各位前辈，我在做小鼠脾淋巴细胞刺激后胞内因子染色过程时，发现没有加刺激物的正常C57小鼠脾脏细胞染色后有很明显的CD4CD8双阳性细胞群（如图1）,做了两次都是如此，求大神支招。
正常C57BL/6脾脏细胞培养24小时染色
我用的是Biolegend的抗体，详细如下：
Biolegend多色抗体
Protocol：
1. 脾脏细胞重悬于5ml10%FBS 1640培养液中，调整细胞浓度至1-2×107个/ml 2. 细胞分为200μl × 4管，分别加入20μl 10×Vac（终浓度10μg/ml），10×WCE（终浓度10μg/ml），20μl 10×PMA（终浓度0.1μg/ml）和20μl 10×PMA Ionomycin（终浓度1μg/ml），20μl PBS 3. 调整好浓度的脾细胞悬液混匀后接种于圆底96孔板，每孔100μ 4. 37℃，5% CO2孵箱培养 20h 5. 各孔加入100μl BFA（2μl/ml in10%FBS 1640），终浓度为1μg/ml 6. 37℃，5% CO2孵箱继续培养 4-6h 7. 4℃，350×g，5min，弃上清 8. 加入100μl含有表面分子抗体的染液，吹打混匀 9. 避光4℃孵育30min 10. 加入150μl标记液，4℃，350×g，5min，弃上清 11. 200μl 标记液洗两遍，离心弃上清 12. 每孔加入50μl Fixbuffer重悬，室温避光固定20min 13. 每孔加入130μlPermeabilization buffer，4℃，350×g，5min，弃上清 14. 200μl Permeabilizationbuffer洗一遍 15. 每孔100μl 含有细胞因子抗体的Permeabilizationbuffer 重悬，吹打混匀 16. 室温避光20min 17. 150μl Permeabilization buffer，4℃，350×g，5min，弃上清 18. 200μl Permeabilization buffer，4℃，350×g，5min，弃上清 19. 200μl Washbuffer洗两遍 20. 200μl固定液固定，4℃避光保存至上机检测
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发表于 2013-10-23 23:59:43
发表于 2013-10-24 08:27:09
