全血标本孵抗体后未能及时检测对结果有何影响？

刘星宇

1、血标本孵育抗体后，（红细胞裂解液含甲醛固定剂），4℃，避光存放8h才上机检测，粒细胞分成了两群，如图一，哪一群属于形态好的细胞？图二是同样的标本孵抗体后立即检测。图三是血标本在4℃存放8h后，孵抗体，立即检测，比图二多一些死细胞，但影响不大。
2、图四是血标本以等体积加入1640，在培养箱培养8h后，孵抗体，立即检测，这两群跟图一的差别在哪？

月下听蝉

未做过全血，发表下愚见。
1.孵育的是什么抗体?是检测粒细胞的吗？
2.图三的区域如果是死细胞，那么图一的A门跟图四的D门也很可能是死细胞。
3.室温长时间孵育或存放是不是让细胞粘在一起（如图一D门FS增大了）？
如果是，建议先接一个FS跟SS分别的信号周期、信号振幅门（如BD的FS-W/FS-H；SS-W/SS-H），去除下黏粘细胞。去除后再接FS/SS看下效果。

刘星宇

月下听蝉 发表于 2013-10-27 00:14

                               
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未做过全血，发表下愚见。
1.孵育的是什么抗体?是检测粒细胞的吗？
2.图三的区域如果是死细胞，那么图一的A ...

@月下听蝉 您好，我们检测的是粒细胞、单核、淋巴细胞表面抗原，非CD类的，图一的A门，图四的D门不是很确定为死细胞，以前培养的全血倒没有出现像图四这么明显的粒细胞分群。继续再做看看。您的建议3，我不是很理解，指细胞成团了？另外，我现在用的是beckman很旧的机子，“W”“H”的参数不知道在哪调。

月下听蝉

刘星宇 发表于 2013-10-27 12:13

                               
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@月下听蝉 您好，我们检测的是粒细胞、单核、淋巴细胞表面抗原，非CD类的，图一的A门，图四的D门不是很确 ...

跑个死细胞的自发荧光门看看，就是跑你没有标记的荧光（在你的激光范围内，不标记这个荧光且不跟已标荧光有冲突的），能跑出阳性，就肯定是死细胞。你可以试试此法比较那两个门的差异，都没有此荧光阳性信号的为最佳！（直接看一维直方图）
第三条。。没有就算了。。

月下听蝉

有核酸染料直接加了看看死活，核酸染料一般都具有慢毒性，个人不倾向使用。。

niwanmao

在外周血中，粒细胞的生存周期最短，印象中似乎是8小时。所以图3存放8小时后，就开始出现少量状态不好的粒细胞（FSC降低），可能是凋亡细胞。而在抗体孵育、全血培养等条件下，粒细胞原有的环境发生了改变，就更容易发生凋亡，所以图一、图四中状态不好的粒细胞比例就更多了。

这里可能会问，为什么加1640培养基了，还这么容易凋亡呢？原代、非肿瘤的细胞就是如此，很难生存，这也是为什么正常人的细胞株都看不到的缘故。这里提一句，即使是肿瘤细胞建株，这个培养也是很需要技术的。因此不能单纯认为加了培养基细胞就肯定能活得很好。

刘星宇

月下听蝉 发表于 2013-10-27 20:51

                               
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跑个死细胞的自发荧光门看看，就是跑你没有标记的荧光（在你的激光范围内，不标记这个荧光且不跟已标荧光 ...

指的是空白对照吗？我做了unstained，isotype control的

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-10-27 21:08

                               
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在外周血中，粒细胞的生存周期最短，印象中似乎是8小时。所以图3存放8小时后，就开始出现少量状态不好的粒 ...

是的，粒细胞离体后，好像是因为呼吸爆发，8h会有不同程度的凋亡。之前还试过先分离中性粒细胞（2个小时才分离出来）再培养8h，状态更不好。我看到文献全血培养24h的，测的是细胞因子水平，我想如果粒细胞状态都不好了，细胞因子水平应该也是有影响的了。
固有的凋亡不能避免，那接下来实验操作更谨慎些，尽量减少操作引起的细胞损伤。

月下听蝉

niwanmao 发表于 2013-10-27 21:08

                               
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在外周血中，粒细胞的生存周期最短，印象中似乎是8小时。所以图3存放8小时后，就开始出现少量状态不好的粒 ...

学习了。倪老师解释到位。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-10-27 23:11

                               
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是的，粒细胞离体后，好像是因为呼吸爆发，8h会有不同程度的凋亡。之前还试过先分离中性粒细胞（2个小时 ...

细胞因子水平应该不会受影响，否则其它人也不会这么做了。