关于单核细胞negative selection of monocytes from PBMC by MACS的问题

xlswy1984

大家好，我最近在用美天旎 的 磁珠分选（Monocyte Isolation Kit II- negative selection），从外周血的PBMC中提取单核细胞，遇到一些问题。
我从 20 mio. frozen PBMC 中，利用磁珠分选，得到了2-3.5mio. 单核细胞
之后用流式上机检测了一下，如下图：

                               
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问题：
1. 理论上PBMC中有10-20%的单核细胞，有人说 MACS分选单核细胞的 出产率非常不稳定，而我的产率也不高。我想请教有经验的人，你们的单核细胞出产率在多少。分选过程中有什么注意事项么？
2. MACS的分选 单核细胞纯度应该在90%以上。 我的FACS检测去除死细胞，好像纯度也够了，但图中的Q3会是什么细胞呢？
3. 我想请教一下，如果用FACS检测，用PI染色圈出活细胞，PI是最后要上机前再加么？我的细胞是要PFA固定的，会有影响么？
4. 我也不知道为什么会有这么多的死细胞或细胞碎片，是因为是复苏的PBMC么，不过这些PBMC 都是近期用密度梯度离心法提取的，冻存的时间不久。 有什么方法可以改进么？

niwanmao

第1个问题是关于MACS分选的，需要@gcz5340 @olivezhou0716  等高手来看看。
第2个问题：Q3可能是残留的淋巴细胞和细胞碎片
第3个问题：PI应该是上机前加的，PFA固定应该不会有影响。
第4个问题：一般冻存过的细胞基本上都会有死细胞或碎片存在，无法避免，但可以通过改善冻存液成份、改善冻存步骤等方式。具体需要根据你的细胞类型进行摸索。

olivezhou0716

看不到你的图啊
单核细胞不同的个体比例差异较大，如果算得率要用分选后的阳性组分细胞数除以上样前单核细胞的总数，不知道这两个数量分别是多少？
单核的去除和阳选都是比较好做的，理论上结果都不会差，我现在看不到数据也无法判断到底怎么样，你可以给我发一份到我邮箱我分析一下：olivez@miltenyibiotec.com.cn
建议分选最好不要用冻存的细胞，效果一般不会太好，活率和碎片是个问题，另外就是细胞容易粘在一起形成团块，不利于过柱。如果细胞团多，最好用滤膜滤一下；死细胞的话可以通过死细胞去除试剂盒排除。最好还是用新鲜的组织。分选后最好是直接上样，不要PFA固定，上机前加PI。希望这个可以对你有所帮助！

月下听蝉

发表下愚见：
1.磁珠产出，一方面PBMC的提取一定要到位，一旦杂细胞流入过多（如红细胞、粒细胞），超过你负选用的抗体的承载量，第一轮产出就会很差，可以多过几次柱子，buffer要一直处于4°。PBMC提取到位，但是冻存不好，导致死细胞增多也会影响磁珠产出。
2.Q3群反向回去看它们在FS/SS的位置，估计不在单核细胞的FS/SS区域。如倪老师说的，不是细胞碎片就是残留的粒细胞之类的。
3.同倪老师。
4.可以去购买些进口的专门冻存PBMC的冻存试剂。效果应该不错。

xlswy1984

niwanmao 发表于 2013-10-29 20:09

                               
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第1个问题是关于MACS分选的，需要@gcz5340 @olivezhou0716  等高手来看看。
第2个问题：Q3可能是残留的淋巴 ...

谢谢您的回答。
关于PI，我还是有些疑问。 我是CD14, CD16抗体染色后，然后固定后，再上机的。那如果我多加一个PI，是不是应该在CD14. CD16 抗体染色后，固定之前呢。
我不太清楚PI 的染色是不是和其他抗体的染色一样的操作。
在调参数的时候，是不是 应设立 unstained， CD14single，CD 16single，PI single， sample， 5个管子啊
感觉细胞固定了以后好像得到的结果比较稳定些。

niwanmao

xlswy1984 发表于 2013-10-29 22:34

                               
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谢谢您的回答。
关于PI，我还是有些疑问。 我是CD14, CD16抗体染色后，然后固定后，再上机的。那如果我多 ...

PI的染色，是应该在表面染色之后的，PI粉剂用PBS配成1ug/ml的PI工作液。
你在完成最后一步离心，去除上清，加入上述PI工作液代替平时的PBS重悬，然后过5分钟上机即可。

但是需要注意的是，你使用的表面抗体里面不能有PE标记的抗体。

至于补偿，你所说的设置是可以的。

xlswy1984

niwanmao 发表于 2013-10-29 22:55

                               
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PI的染色，是应该在表面染色之后的，PI粉剂用PBS配成1ug/ml的PI工作液。
你在完成最后一步离心，去除上清 ...

我们实验室 有 PI 是 Biolegend公司买的那种，推荐的是10ul per 1mio. cells
那是不是就应该像一般抗体那样最后加个2ul。
对了，请问为什么不能有PE 呀？

niwanmao

xlswy1984 发表于 2013-10-29 23:22

                               
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我们实验室 有 PI 是 Biolegend公司买的那种，推荐的是10ul per 1mio. cells
那是不是就应该像一般抗体那 ...

你们那种PI染液是不是用来做细胞周期的？那不行的，那种染液所有的细胞都会染上。

因为PI和PE通道是一样的，不能一起测（有些coulter机器似乎在FL3检测）