为何同型对照管表达阳性？

一丁点儿

今天做调节T，发现在同型对照管就出现了FoxP3阳性的细胞，甚至可见调节T细胞。之前有一次也遇到了这样的情况，当时做了两份标本，两份标本的对照管都变成了FoxP3阳性，但是，老师经过洗机和重启之后，其中一份标本的对照管的FoxP3阳性变成阴性了，另外那份对照已经是FoxP3阳性 。今天只做了一份标本，对照管和测定管的FoxP3都阳性，反复上机都是，但是发现一个奇怪的现象就是测定管的细胞成群位置有变化，老师说不知道是不是光路有问题，经过洗机、质控、大清洗，再测了一次依旧是对照管的FoxP3阳性。和试剂的技术支持联系了下，处理步骤没有问题，而且，很肯定的是，对照管的抗体是加的同型对照。求大侠们给予指导，谢谢！

niwanmao

核内标记影响因素很多，我个人体会是同型对照和选择正确性、破膜剂的好坏以及是否新鲜配置、实验步骤的时间等都会影响。

一丁点儿

niwanmao 发表于 2013-11-30 05:19

                               
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核内标记影响因素很多，我个人体会是同型对照和选择正确性、破膜剂的好坏以及是否新鲜配置、实验步骤的时间 ...

破膜剂和抗体都是ebioscience的，只不过不是Treg的试剂盒，破膜剂都是加之前的半个小时左右才配的，Treg一共做了十多次，就这两次出现这样的事情，处理的步骤都是一样的，处理的人也是一样的。这种情况实在是纳闷儿又无助。。。

niwanmao

一丁点儿 发表于 2013-11-30 19:08

                               
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破膜剂和抗体都是ebioscience的，只不过不是Treg的试剂盒，破膜剂都是加之前的半个小时左右才配的，Treg ...

ebioscience的foxP3破膜剂我用过，个人也感觉有点不太稳定。
不过从这两幅图片看，我个人觉得更倾向同型对照非特异性染色太高。不知道你以前那几次好的结果中，同型对照和foxP3的图是怎么样的？能否传上来看看

一丁点儿

niwanmao 发表于 2013-11-30 20:24

                               
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ebioscience的foxP3破膜剂我用过，个人也感觉有点不太稳定。
不过从这两幅图片看，我个人觉得更倾向同型 ...

谢谢老师的回复。
因为做的是多色，里面有一个美天妮的抗体，建议加FcR阻断剂，因此，我在加所有抗体之前加了阻断剂，孵育30min,然后再加的其他抗体。

niwanmao

一丁点儿 发表于 2013-12-1 00:49

                               
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谢谢老师的回复。
因为做的是多色，里面有一个美天妮的抗体，建议加FcR阻断剂，因此，我在加所有抗体之前 ...

从这两张图片看，应该处理和试剂上不大有问题，那估计还是你们机器稳定性上的问题。你们的流式细胞仪是不是比较老了？

dragonhzqsmmu

关注一下事情的解决情况，为将来做实验做准备

一丁点儿

niwanmao 发表于 2013-12-1 11:13

                               
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从这两张图片看，应该处理和试剂上不大有问题，那估计还是你们机器稳定性上的问题。你们的流式细胞仪是不 ...

好像貌似是差不多三年多了吧，是BD的CantoII，老师说叫我再做一次试试，如果再出现这样的情况就叫仪器公司的过来看看。但是，奇怪的是，在我出现这两次异常情况之间，有别人做六色的，都没有出现任何异常情况。。。

niwanmao

一丁点儿 发表于 2013-12-1 21:21

                               
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好像貌似是差不多三年多了吧，是BD的CantoII，老师说叫我再做一次试试，如果再出现这样的情况就叫仪器公 ...

之前的内容来看，你的试剂和处理步骤都似乎没有问题，那是只能从仪器找问题，而从你这里的描述来看，仪器也能够保证没问题，那真找不出问题了。

但这又不太可能，应该是其中哪个方面出问题而你们没有注意吧。
我建议：
1、下次做的时候首先保证步骤没问题，试剂没过期，破膜剂新配。
2、上机时，注意电压与上次正常时的配置是否一样。

一丁点儿

niwanmao 发表于 2013-12-1 21:48

                               
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之前的内容来看，你的试剂和处理步骤都似乎没有问题，那是只能从仪器找问题，而从你这里的描述来看，仪器 ...

是啊，这样的事情确实蹊跷。每次的操作步骤都是一样的，试剂也是同一管抗体，破膜剂也都是破膜前半个小时到一个小时才配的。上机的时候，我最多就是调下FSC和SSC的电压，让细胞分群明显点，其他的设置都不动。出现的问题的时候我就找做流式的老师给我看了，他还清洗了仪器和质控，结果还是出现对照管阳性。。。真是觉得。。。我想，明天再做做看看，实在是不知道问题在哪里了。。。