分析细胞表面抗原，同时也做细胞周期分析，该如何染色？

天使爱美丽810

各战友好！我现在分析细胞表面多种抗原，并发现存在着有2个细胞群，我同时也要分析2个细胞群的周期。请问我该如何染色？先染荧光抗体，然后再用预冷的70%乙醇固定后，再染PI？？固定在4℃过夜固定后，上流式分析其他荧光抗体会不会受到影响呢？请赐教！！O(∩_∩)O谢谢

niwanmao

用PI很难值，可改用7-AAD，详细步骤参见：[流式protocol] 同时检测细胞表面抗原和DNA/RNA含量

天使爱美丽810

谢谢老师！但是我还是点不明白：1、Nucleic acid staining solution (NASS) (pH 4.8)是用来稀释7-AAD的，它所起到的作用是什么呢？2、如果不检测RNA的含量就不需要Actinomycin D (AD) 和Pyronin Y(G)的染色了是吗？3、使用7-AAD检测DNA含量不需要预冷的70%乙醇固定吗？

niwanmao

天使爱美丽810 发表于 2013-12-21 12:14
谢谢老师！但是我还是点不明白：1、Nucleic acid staining solution (NASS) (pH 4.8)是用来稀释7-AAD的，它 ...

核酸染色液（NASS）不是用来稀释的，它的成份昨天我忘了附上，今天已经补上了，其中的皂素（saponin）是起到破膜作用的，也就是代替乙醇的作用 ，其优势就是作用比较温和，所以比较适合和表面抗原一起标记。而如果用乙醇固定的话，容易使细胞形态、表面标记受到较大影响。

如果不想检测RNA含量，第8步不做即可（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3034-1-1.html）。

天使爱美丽810

好的！太感谢您了！

sally_no10

乙醇固定的破坏性是极大的.如果可以使用别的方法固定,那么染料上也好选了.HO33342好像也可以.不过我没用过.还得请教一下@niwanmao

niwanmao

sally_no10 发表于 2013-12-23 23:38
乙醇固定的破坏性是极大的.如果可以使用别的方法固定,那么染料上也好选了.HO33342好像也可以.不过我没用过. ...

HO33342可能由于激发光的问题，现在多用于荧光显微镜核染色，在流式上做细胞周期似乎不多见。

feireiro

现在还有商品化的固定剂配合PI使用，不需要使用70%冰乙醇过夜固定；只需要加固定剂孵育1分钟，然后直接染PI就可以了。

niwanmao

feireiro 发表于 2013-12-24 15:10
现在还有商品化的固定剂配合PI使用，不需要使用70%冰乙醇过夜固定；只需要加固定剂孵育1分钟，然后直接染PI ...

噢？具体的厂家和商品名称有吗？是不是跟BD cycletest plus里面的那种类似

feireiro

Beckman的DNA  Prep Reagents Kit，包括DNA PREP LPR：非离子去垢剂和氰化钾，用于细胞破膜打孔
和DNA PREP Stain：含有PI染料浓度50μg/mL和RNAse