关于凋亡十字门的问题

lin850424

用annexin-v-FITC检测CD4APC和CD25PE标记的双阳细胞的早期凋亡，我是这么做的，圈出CD4CD25双阳细胞，然后再画一散点图，显示双阳细胞的凋亡，横坐标设为CD4(或CD25)，纵坐标设为FITC,问题就是设门设在哪里？我是应该根据空白设门，还是根据单标画十字门？十字门画完后是不是下一组就不能动了，还要用此门检测这一组双阳细胞的凋亡？
比如下面这个图有哪些问题？

niwanmao

你指的是FITC、APC散点图的十字门吧？那个根据正常细胞（基本上无凋亡）的来设。
一旦设好之后，尽量别动，除非因为非特异荧光而发生明显偏移的。
一般说来，ANNEXIN V的分群基本上还是不错的，设门还是比较容易。你这里的图形我觉得问题不大。

lin850424

niwanmao 发表于 2014-2-7 18:06
你指的是FITC、APC散点图的十字门吧？那个根据正常细胞（基本上无凋亡）的来设。
一旦设好之后，尽量别动， ...

因为是淋巴细胞养了几天，所以正常细胞组也有凋亡了啊，这个暂且不说，但是根据正常细胞画好的门，在实验组中用密度图发现，阴性的细胞群压过了之前设的门（有的组压过线了，有的组就没有），所以我的问题是这个时候我的门到底动还是不动，因为动一点，凋亡值变化还是很大的。

niwanmao

lin850424 发表于 2014-2-7 19:08
因为是淋巴细胞养了几天，所以正常细胞组也有凋亡了啊，这个暂且不说，但是根据正常细胞画好的门，在实验 ...

你这里CD4＋CD25＋的细胞数量少，密度图似乎不太准确。我的建议是就用上面这个位置，不动。

watson77

用新鲜制备的细胞染色（Annexin V，最好也染上CD4和CD25）做阴性对照，划门在阳性<1%。
划好后就不能动，否则没可比性。

lin850424

watson77 发表于 2014-2-8 08:50
用新鲜制备的细胞染色（Annexin V，最好也染上CD4和CD25）做阴性对照，划门在阳性 ...

嗯，好的

lin850424

niwanmao 发表于 2014-2-7 19:30
你这里CD4＋CD25＋的细胞数量少，密度图似乎不太准确。我的建议是就用上面这个位置，不动。 ...

我说错了，是等高图压线了，不是密度图啊，等高图细胞少了也不准？

niwanmao

lin850424 发表于 2014-2-8 10:29
我说错了，是等高图压线了，不是密度图啊，等高图细胞少了也不准？

细胞少了，这两种图都不太好。

钢蛋儿

楼主做的图怎么样了？测双标的凋亡需要设置的哪些管呢？
这样行吗：
第一次：
管1：阴性管（无染色）
管2：PE单染
管3 :APC单染
管4：PE + APC双标
管5：PE+ APC+ Annexin V-FITC三标
然后以后试验就可以电压不变，只设置管5了。是这样吗？

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2014-2-12 22:16
楼主做的图怎么样了？测双标的凋亡需要设置的哪些管呢？
这样行吗：
第一次：

以后电压一般不变，由于我们分析的主要指标是ANNEXIN V FITC，本来需要设置管2或管4做FMO对照，但由于ANNEXIN V分群清楚，故不需要设。但由于CD25 PE的分群可能不清楚，如楼主那个图，故可在管5基础上加一管CD4 APC单染。