流式检测有丝分裂指数

周利

最近要做有丝分裂指数分析，查了个Protocol

注意:所有的离心均为2000 rpm，5 min.

1.        收集细胞后用 500 ul PBS 洗一次，用150ul PBS重悬，然后加350ul乙醇。混合并放在4度至少一个小时。

2.        离心除去乙醇，用含有0.25% Triton X-100 的500ul PBS重悬，并且冰上孵育15分钟。

3.        离心后，细胞重悬在100 μl含有1% BSA 和0.25 μg组蛋白H3的单克隆抗体或者0.06ug MPM-2 单克隆抗体的PBS中。在室温下孵育1个小时。

注意: 这步后，细胞组分变得松动，因此最好用移液器去去除溶液而不是用真空吸。, cell

4.        离心后用150 μl含有 1% BSA 的PBS 洗一次。

5.        用100ulPBS（含有1% BSA） 1：300稀释的Alexa 488-接合羊抗鼠免疫球蛋白g抗体重选细胞，在黑暗下室温孵育30min。

6.        离心后，用含有10 μg/ml RNase A和 20 μg/ml 碘化丙啶的500ul的PBS重悬细胞。转移到FACS管中并且在黑暗下室温孵育30min 。

7.        直接进行FACS试验或者存于4 °C。

RNase是为了消除双链RNA的干扰，PI是为了染DNA，这我知道，但我不懂怎么分析，是把PI阳性的圈出来再看H3的阳性率吗？和周期分析有什么差别呢？请赐教！

dragonhzqsmmu

下载到全文了，大家共同学习一下吧

niwanmao

RNA酶肯定是为了去除所有的RNA干扰，因为PI也会染RNA的，导致的分析时可能会干扰。
至于更具体的分析，因为我也没做过这个组蛋白的抗体，不过建议你参考这篇2006年的经典文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17623920

由于这篇文章我也没权限下载全文，故找了一个Abcam的产品介绍中的图供您参考，似乎H3的Ser10磷酸化就提示发生了有丝分裂，是这个道理吧？（见下图）