PBMC的CD25-PE-Cy7 一直标记不上~

钢蛋儿

1． 1×106个细胞，4℃ 1500rpm 5min 离心弃上清（此步未加100μlPBS重悬细胞，因为弃上清时都是倒置5s，应该有回流的残液)。
2． 加入5ulBD biosciences的CD25-PE-Cy7 货号557741，吹打数次（大概吹打10次），涡旋振荡器涡旋5s。
3．4 ℃ 下避光反应30min。
4．用4ml PBS 4 ℃ 1500rpm 5min 离心弃上清。
5． 加入200μl 4% 多聚甲醛（谷歌生物）固定（此步未重悬细胞），4℃避光保存。
6．一周后上机（因为流式仪不方便），基本未见荧光。
注：操作保证全程避光。CD25-PE-Cy7买了不到1年，一直4 ℃避光保存。
请老师们看下哪里出了岔子！出16流星求助……

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2014-3-21 23:56
还有几个问题，
1、如果固定的话，多聚甲醛1%~4%哪个效果好点？
2、看到课件上说PE最强，适用于弱表达抗原 ...

1、工作液基本上都是用1％，偶可用2％。
2、PE-cy7也不算很弱，关键还是上机的时间不要太久，24小时内我觉得是要保证的。所以安排好预约时间和你标本处理时间之间的关系很重要。
3、这个残液上，我觉得你尽量用轻柔的手法倒干，因为洗涤就是为了洗去游离的抗体，如果残液太多，等于洗涤的目的就达不到了。重悬还是有必要的，100ul并不是一个严格的要求，自己可以灵活把握。

dragonhzqsmmu

为什么要一周后才检测？能否标记完当时就测一下，可以排除是因为时间的原因导致荧光淬灭了

不行重新买一个小包装的抗体试试，这个荧光比较弱啊，考不考虑换成APC的？时间比金钱贵啊

坐等高手和版主解答

niwanmao

检测时间太长了，绝对检测不到，再不方便也不能这样安排。你为什么不先预约好，然后在预约时间前一天处理？

钢蛋儿

dragonhzqsmmu 发表于 2014-3-21 09:46
为什么要一周后才检测？能否标记完当时就测一下，可以排除是因为时间的原因导致荧光淬灭了

不行重新买一个 ...

不知道啊，PE-Cy7这个荧光很弱吗？……我的搭配如下
CD3 BD公司 percp cy5.5 激发波长 488 发射波长 695
CD4 BD公司 FITC 激发波长488 发射波长  530
CD25 BD公司 PE-Cy7 激发波长488 发射波长 767
Foxp3 eB公司 PE 激发波长488 发射波长 578
IL-17  Alexa  Fluor 647 激发波长488 发射波长 668
但是CD3 CD4用4%多聚甲醛固定了几周检测也没影响啊？

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-3-21 11:34
检测时间太长了，绝对检测不到，再不方便也不能这样安排。你为什么不先预约好，然后在预约时间前一天处理？ ...

谢谢倪老师，不过CD3 CD4 固定几周仍可以检测到，是不是CD25表达本来就少，结果固定之后更少了？还是PE-Cy7荧光比较弱？

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2014-3-21 15:59
谢谢倪老师，不过CD3 CD4 固定几周仍可以检测到，是不是CD25表达本来就少，结果固定之后更少了？还是PE-C ...

固定几周还能检测到对于那些稳定的荧光素可能还可以，但对于PE－cy7这种串联染料就肯定不行。再加上CD25确实表达也少，更加不行。

而且，如果你比较新鲜的CD3、CD4和几天后的CD3、CD4，就会发现荧光强度根本不会一样。

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-3-21 19:37
固定几周还能检测到对于那些稳定的荧光素可能还可以，但对于PE－cy7这种串联染料就肯定不行。再加上CD25 ...

弱荧光+弱表达+固定，完了~~~

钢蛋儿

还有几个问题，
1、如果固定的话，多聚甲醛1%~4%哪个效果好点？
2、看到课件上说PE最强，适用于弱表达抗原；FITC最便宜，适用于强表达抗原。如果想测 CD3 CD8 CD25 FoxP3 IL-17，我上边回帖中的荧光选择有问题吗？ 因为CD25、Foxp3、IL-17都只是弱表达……3、加抗体孵育前有的是加入100uLPBS重悬，但我只用几十uL残液应该对吧？觉得这样抗体效价更高一点

谢谢各位

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-3-22 09:38
1、工作液基本上都是用1％，偶可用2％。
2、PE-cy7也不算很弱，关键还是上机的时间不要太久，24小时内我 ...

非常感谢，我要赶紧调整方案~~