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[淋巴细胞相关] PBMC的CD25-PE-Cy7 一直标记不上~

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发表于 2014-3-20 23:50:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏16流星已解决
本帖最后由 钢蛋儿 于 2014-3-20 23:52 编辑

1. 1×106个细胞,4 1500rpm 5min 离心弃上清(此步未加100μlPBS重悬细胞,因为弃上清时都是倒置5s,应该有回流的残液)。
2. 加入5ulBD biosciences的CD25-PE-Cy7 货号557741,吹打数次(大概吹打10次),涡旋振荡器涡旋5s。
3.4 下避光反应30min。
4.用4ml PBS 4 1500rpm 5min 离心弃上清。
5. 加入200μl 4% 多聚甲醛(谷歌生物)固定(此步未重悬细胞),4
℃避光保存
6一周后上机(因为流式仪不方便),基本未见荧光。
注:操作保证全程避光。CD25-PE-Cy7买了不到1年,一直4 ℃避光保存。
请老师们看下哪里出了岔子!出16流星求助……



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1、工作液基本上都是用1%,偶可用2%。 2、PE-cy7也不算很弱,关键还是上机的时间不要太久,24小时内我觉得是要保证的。所以安排好预约时间和你标本处理时间之间的关系很重要。 3、这个残液上,我觉得你尽量用轻柔的手法倒干,因为洗涤就是为了洗去游离的抗体,如果残液太多,等于洗涤的目的就达不到了。重悬还是有必要的,100ul并不是一个严格的要求,自己可以灵活把握。 ...
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2014-3-20 23:50:18 | 显示全部楼层
钢蛋儿 发表于 2014-3-21 23:56
还有几个问题,
1、如果固定的话,多聚甲醛1%~4%哪个效果好点?
2、看到课件上说PE最强,适用于弱表达抗原 ...

1、工作液基本上都是用1%,偶可用2%。
2、PE-cy7也不算很弱,关键还是上机的时间不要太久,24小时内我觉得是要保证的。所以安排好预约时间和你标本处理时间之间的关系很重要。
3、这个残液上,我觉得你尽量用轻柔的手法倒干,因为洗涤就是为了洗去游离的抗体,如果残液太多,等于洗涤的目的就达不到了。重悬还是有必要的,100ul并不是一个严格的要求,自己可以灵活把握。
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发表于 2014-3-21 09:46:09 | 显示全部楼层
为什么要一周后才检测?能否标记完当时就测一下,可以排除是因为时间的原因导致荧光淬灭了

不行重新买一个小包装的抗体试试,这个荧光比较弱啊,考不考虑换成APC的?时间比金钱贵啊

坐等高手和版主解答
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发表于 2014-3-21 11:34:42 来自手机 | 显示全部楼层
检测时间太长了,绝对检测不到,再不方便也不能这样安排。你为什么不先预约好,然后在预约时间前一天处理?
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 楼主| 发表于 2014-3-21 15:56:21 | 显示全部楼层
本帖最后由 钢蛋儿 于 2014-10-25 23:12 编辑
dragonhzqsmmu 发表于 2014-3-21 09:46
为什么要一周后才检测?能否标记完当时就测一下,可以排除是因为时间的原因导致荧光淬灭了

不行重新买一个 ...

不知道啊,PE-Cy7这个荧光很弱吗?……我的搭配如下
CD3 BD公司 percp cy5.5 激发波长 488 发射波长 695
CD4 BD公司 FITC 激发波长488 发射波长  530
CD25 BD公司 PE-Cy7 激发波长488 发射波长 767
Foxp3 eB公司 PE 激发波长488 发射波长 578
IL-17  Alexa  Fluor 647 激发波长488 发射波长 668
但是CD3 CD4用4%多聚甲醛固定了几周检测也没影响啊?
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 楼主| 发表于 2014-3-21 15:59:49 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-3-21 11:34
检测时间太长了,绝对检测不到,再不方便也不能这样安排。你为什么不先预约好,然后在预约时间前一天处理? ...

谢谢倪老师,不过CD3 CD4 固定几周仍可以检测到,是不是CD25表达本来就少,结果固定之后更少了?还是PE-Cy7荧光比较弱?
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发表于 2014-3-21 19:37:10 | 显示全部楼层
钢蛋儿 发表于 2014-3-21 15:59
谢谢倪老师,不过CD3 CD4 固定几周仍可以检测到,是不是CD25表达本来就少,结果固定之后更少了?还是PE-C ...

固定几周还能检测到对于那些稳定的荧光素可能还可以,但对于PE-cy7这种串联染料就肯定不行。再加上CD25确实表达也少,更加不行。

而且,如果你比较新鲜的CD3、CD4和几天后的CD3、CD4,就会发现荧光强度根本不会一样。
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 楼主| 发表于 2014-3-21 23:53:26 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-3-21 19:37
固定几周还能检测到对于那些稳定的荧光素可能还可以,但对于PE-cy7这种串联染料就肯定不行。再加上CD25 ...

弱荧光+弱表达+固定,完了~~~
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 楼主| 发表于 2014-3-21 23:56:21 | 显示全部楼层
本帖最后由 钢蛋儿 于 2014-3-22 00:07 编辑

还有几个问题,
1、如果固定的话,多聚甲醛1%~4%哪个效果好点?
2、看到课件上说PE最强,适用于弱表达抗原;FITC最便宜,适用于强表达抗原。如果想测 CD3 CD8 CD25 FoxP3 IL-17,我上边回帖中的荧光选择有问题吗? 因为CD25、Foxp3、IL-17都只是弱表达……3、加抗体孵育前有的是加入100uLPBS重悬,但我只用几十uL残液应该对吧?觉得这样抗体效价更高一点

谢谢各位
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 楼主| 发表于 2014-3-22 10:04:43 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-3-22 09:38
1、工作液基本上都是用1%,偶可用2%。
2、PE-cy7也不算很弱,关键还是上机的时间不要太久,24小时内我 ...

非常感谢,我要赶紧调整方案~~
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