鱼类多倍体检测（DNA含量），十万火急！

jordanping23 · 发表于 2014-4-13 23:23:33

本帖最后由 jordanping23 于 2014-7-22 22:34 编辑

样品制备：1、抽取鱼尾静脉血0.1ml，加入2mlPBS或者生理盐水中，1000rpm 10Min，重复两次，后重悬至0.1ml（这个时候再显微镜下镜检，可见到清楚、完整的红细胞）；

2、加入-20℃预冷的70%乙醇，在-20℃下孵育2小时以上。存在问题：无论预冷乙醇逐滴加入到纯红细胞悬液（边加边用旋涡混匀器震荡混匀，之前怕速度大了细胞破裂，还直接吸取预冷乙醇加入到离心后的红细胞中，抽吸数次混匀），还是纯红细胞缓慢加入到预冷乙醇中，都很容易产生絮状物，这时过滤（200目）镜检，基本看不到单细胞。论坛上各种protocol，有单细胞悬液缓慢加入到预冷乙醇，也有预冷乙醇逐滴加入到纯红细胞悬液，不知问题出在哪里。

3、洗涤两次，以除去乙醇。第一次洗涤用1×PBS和第二次洗涤用染色缓冲液中。

4、在1,000 rpm 10Min下离心细胞，10分钟，吸出上清液。

5、避光染色，染料采用BD的PI/RNase Staining Buffer 0.5ml（这个染色液是否含有RNase，我没有再加RNase）。存在问题：说明里面说调整至106个细胞，这个我没有做，不知道如何才能调整到106个；

6、在室温下静置30min；

7、分析之前，存储管在4℃下避光，1一个小时内，通过流式细胞仪进行分析。这是我之前结果的截图，图4。希望做过

dragonhzqsmmu · 发表于 2014-4-14 11:31:46

这个多倍体检测是否是检测红细胞的？应该是检测白细胞的吧？

如果是检测白细胞的话，应该要用红细胞裂解液裂红去掉红细胞的干扰吧

看了calibur的设置，荧光补偿和电压不需要调整吗？

鱼类没有做过，搞不清楚，这个问问版主看看

jordanping23 · 发表于 2014-4-14 11:58:14

dragonhzqsmmu 发表于 2014-4-14 11:31
这个多倍体检测是否是检测红细胞的？应该是检测白细胞的吧？

如果是检测白细胞的话，应该要用红细胞裂解液 ...

是红细胞核里的DNA含量，根据不同含量来确定倍性。鱼类的红细胞是有细胞核的。

niwanmao · 发表于 2014-4-14 13:16:24

jordanping23 发表于 2014-4-14 11:58
是红细胞核里的DNA含量，根据不同含量来确定倍性。鱼类的红细胞是有细胞核的。 ...

鱼类没做过，根据你的描述，鱼类应该都是有核红，但是你即使经过洗涤，其中的白细胞应该还是不少的。
不知道鱼类的红细胞大小是不是也象人类那么小，如果很小的话，得通过FSC（log）/SSC(log)设门来圈，象你上面用Lin模式圈出的基本上应该都是白细胞。
至于周期的分析，还是需要用Modfit这类专业软件分析。

为了确定多倍体，我觉得你是不是可以找一种单倍体作为标准参照？

jordanping23 · 发表于 2014-4-14 19:28:15

dragonhzqsmmu 发表于 2014-4-14 11:31
这个多倍体检测是否是检测红细胞的？应该是检测白细胞的吧？

如果是检测白细胞的话，应该要用红细胞裂解液 ...

确定是检测红细胞。

jordanping23 · 发表于 2014-4-14 19:34:30

niwanmao 发表于 2014-4-14 13:16
鱼类没做过，根据你的描述，鱼类应该都是有核红，但是你即使经过洗涤，其中的白细胞应该还是不少的。
不 ...

1、确定是否是多倍体，找一个确定是二倍体的同一种的鱼，通过二者的DNA含量对比就可以实现，不需要单倍体；
2、鱼类红细胞有细胞核，也是比较小的；
3、目前，就是我制备的单细胞悬液，到了用乙醇固定的时候，就出现絮状，红细胞都凝在一起了，不知道问题出现在哪？根据你们的实践经验，是单细胞悬液缓慢加入到预冷乙醇里面还是乙醇逐滴加入到单细胞悬液中，边滴加边涡旋？还有就是多少量的单细胞悬液和多少量乙醇，是否我的单细胞悬液太多了，而乙醇太少了？

niwanmao · 发表于 2014-4-14 20:59:49

jordanping23 发表于 2014-4-14 19:34
1、确定是否是多倍体，找一个确定是二倍体的同一种的鱼，通过二者的DNA含量对比就可以实现，不需要单倍体 ...

我们平时做的比较多的是正常人和肿瘤标本的细胞，采用的是细胞悬液滴入乙醇的方法，边滴边振荡。对乙醇量没有规定，一般乙醇量尽量多一点。

如果无论如何你都无法解决絮状沉淀的问题，我建议你试试BD Cycletest plus，那个试剂盒可以直接处理新鲜标本，无需用乙醇固定。不过我只用这个试剂盒做过人外周血和骨髓标本，未做过鱼类的，从原理上看应该可行，你实在没办法时可以试试。

jordanping23 · 发表于 2014-4-14 21:30:28

niwanmao 发表于 2014-4-14 20:59
我们平时做的比较多的是正常人和肿瘤标本的细胞，采用的是细胞悬液滴入乙醇的方法，边滴边振荡。对乙醇量 ...

谢谢！你们做人外周血的时候没碰见过絮状沉淀么？做人外周血和鱼类应该是差不多的，我大概0.1ml的纯红细胞经过洗涤3次之后再用0.1ml的PBS重悬，后缓慢滴加到4ml预冷70%乙醇中，边滴边震荡。您觉得我的问题出在哪儿呢？步骤和你们做的一样吗？

niwanmao · 发表于 2014-4-14 22:18:03

jordanping23 发表于 2014-4-14 21:30
谢谢！你们做人外周血的时候没碰见过絮状沉淀么？做人外周血和鱼类应该是差不多的，我大概0.1ml的纯红细 ...

做人的外周血从来没碰到过，反而做培养的细胞时碰到过，一般是由于细胞状态差。
不过我们平时做的都不是红细胞，而是白细胞、肿瘤细胞等，所以对乙醇抵抗能力较强，估计红细胞膜比较脆弱，所以容易被乙醇破坏而死亡。

所以，我建议你可以从别人那里先借用一个test的BD Cycle test plus试试。

jordanping23 · 发表于 2014-4-14 22:38:03

niwanmao 发表于 2014-4-14 22:18
做人的外周血从来没碰到过，反而做培养的细胞时碰到过，一般是由于细胞状态差。
不过我们平时做的都不是 ...

BD Cycle test plus 什么价格？

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