ROS和线粒体膜电位圈门问题

格利雅

药物诱导细胞凋亡，利用AnnexinV和PI检测凋亡，再用JC-1检测线粒体膜电位，DFCH检测ROS，问题是在流式检测凋亡、线粒体膜电位和ROS时，FSC/SSC是圈非碎片的所有细胞还是只圈状态好的活细胞(P4 or P5)？

niwanmao

ROS和线粒体膜电位属于早期事件，所以这时的细胞形态应该是没有明显变化的，所以建议采用P4。

cccssszzz08

这些实验我都做过，个人认为只圈P4即可。因为不管是JC-1测膜电位还是DCFH测ROS，都是针对完整细胞形态的正常细胞内的事件进行分析的，所以直接圈正常细胞即可。

格利雅

niwanmao 发表于 2014-4-18 20:51
ROS和线粒体膜电位属于早期事件，所以这时的细胞形态应该是没有明显变化的，所以建议采用P4。 ...

谢谢老师！那么在用AnnexinV和PI测凋亡时，FSC/SSC圈门是应该圈出各种状态的细胞吧（P5门）？圈门后在FITC/PI图中，标记FITC+PI-的早调细胞群，在FSC/SSC图中大部分却是在靠近SSC的细胞群中，是说明早调细胞的形态就有改变了么？还是样本自身死细胞较多造成的？

格利雅

cccssszzz08 发表于 2014-4-19 08:44
这些实验我都做过，个人认为只圈P4即可。因为不管是JC-1测膜电位还是DCFH测ROS，都是针对完整细胞形态的正 ...

谢谢！圈P4门后，JC-1测得结果貌似和看到的标准图差别比较大呀，调节补偿也不能正常，帮忙看下这个正常么？

niwanmao

格利雅 发表于 2014-4-19 09:32
谢谢老师！那么在用AnnexinV和PI测凋亡时，FSC/SSC圈门是应该圈出各种状态的细胞吧（P5门）？圈门后在FIT ...

部分介于早期凋亡和晚期凋亡之间，或者早期凋亡较晚阶段的细胞，会发生FSC改变。所以AV/PI时是需要圈P5。

niwanmao

格利雅 发表于 2014-4-19 10:05
谢谢！圈P4门后，JC-1测得结果貌似和看到的标准图差别比较大呀，调节补偿也不能正常，帮忙看下这个正常么 ...

我觉得，象P4门内那样FL1增高、FL2降低更能反映以下原理：
正常细胞的线粒体膜电位电压较高，可形成JC-1的聚集体，发出红色荧光，而线粒体膜电位降低的细胞，则会形成JC-1单体，发出绿色荧光。

cccssszzz08

格利雅 发表于 2014-4-19 10:05
谢谢！圈P4门后，JC-1测得结果貌似和看到的标准图差别比较大呀，调节补偿也不能正常，帮忙看下这个正常么 ...

确实很奇怪，感觉你圈左边的那个团出的JC-1结果较为正常。我原来做膜电位是用RH123做的，JC-1只是见文献上的图了，和你底下的那排比较接近。但是这个图能反应你想要的结果吗？

格利雅

cccssszzz08 发表于 2014-4-20 20:53
确实很奇怪，感觉你圈左边的那个团出的JC-1结果较为正常。我原来做膜电位是用RH123做的，JC-1只是见文献 ...

圈左边那群细胞也是随着加药浓度升高，JC-1图中细胞群整体逐渐下移；而圈右边正常细胞群，JC-1图中，我想是不是就是分别圈出左上和右下两群细胞，左上认为是FL2阳性线粒体膜电位高的细胞群，右下认为是FL1阳性线粒体膜电位低的细胞群，比较右下细胞群的比例变化。各位老师觉得这样合理么？@niwanmao @cccssszzz08

niwanmao

格利雅 发表于 2014-04-20 21:44:02

                               
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圈左边那群细胞也是随着加药浓度升高，JC-1图中细胞群整体逐渐下移；而圈右边正常细胞群，JC-1图中，我想

没错，就是这样分析