GFP和RFP融合表达质粒转染293T 后分选GFP阳性细胞，散点图奇怪

椴树

RFP加了一个linker后接了一个GFP，转染293T细胞，理论上RFP肯定都表达，因为linker的原因，GFP的表达不是100%，我转染后48h （细胞已经长的非常拥挤了）用胰酶消化细胞，培养基终止反应，离心弃上清后未用PBS洗就直接用含10%FBS的PBS（含双抗）重悬，然后过40um滤网后上机分选GFP阳性的细胞。我先是准备了未处理的293T细胞做双阴性对照，然后转染了GFP质粒的293T做荧光补偿（老师说一般RFP不用调了，我就没准备），上GFP调节补偿的时候发现补偿调节到36 才能把峰压下去，而且此时在散点图的UR区域的最右边好像分散一些细胞一样，想知道是什么原因造成的？在PE-A的峰型图上也可以看到这些点好像在阴性峰右边有一条竖线一样的峰。不管补偿调节多高，这些细胞都存在，而且我后面的几组实验组中，这些细胞也在，同时我的散点图很难看，它不是分群的感觉，感觉就是沿着对角线分布，这又是火箭峰了么？
PS 我这些细胞里 在荧光显微镜下看实验组4的红色和绿色荧光强度都要强些，实验组1和2是绿色强于红色，实验组3是都很弱

niwanmao

这是由于FL1荧光过强造成的，在临床上有时候也会碰到。
这种没有办法调，因为你所用的流式细胞仪其检测范围已经固定了，所以超出该检测范围的荧光它只能在右侧形成一条异常的线。

只能通过如下手动画门来分析：

手动画门

椴树

niwanmao 发表于 2014-4-27 18:43
这是由于FL1荧光过强造成的，在临床上有时候也会碰到。
这种没有办法调，因为你所用的流式细胞仪其检测范围 ...

谢谢老师  我不太明白为什么要这样划门？ 是只根据细胞的分群情况么？那我前面做双阴性对照和补偿对照的意义又是什么呢？老师请问 我的P2 门有问题么？ 我最后收的是P2门里的细胞，从实验组四的图来看 我其实是丢失了那些 荧光强度非常强的细胞的是么？ 我虽然有RFP和GFP 但是我只收GFP阳性的细胞，那我还需要做补偿对照么？ 我找了文献的图 它的图也是对角线上 不过他都是在对角线左上 我是在左下 他给的双阳性细胞23% 的比率是合适的么？看他也是单纯的十字门

niwanmao

椴树 发表于 2014-4-27 20:24
谢谢老师  我不太明白为什么要这样划门？ 是只根据细胞的分群情况么？那我前面做双阴性对照和补偿对照的 ...

问题好多，我试着一个个回答看。
1、前面的画门考虑确实是根据其表达分布。
2、做双阴性为了电压调节，做单阳性是为了补偿，但从你这个图看，补偿还是调整过度了，因为尽管最强的细胞贴在壁上没下去，但有没有发现X轴也有不少阳性细胞贴壁。做单阳性确实是为了补偿，但有时候由于实验标本表达该抗原过强，或其它因素干扰，会导致分布略微上抬，这是允许的，所以也是现在不少分析软件中允许对十字门4条线变换角度的缘故。
3、一般来说，对于这类标本，不建议用直方图分析，但如果单纯是分选，是可以的，但建议你把P2画到X轴最右侧。
4、那些荧光最强的信号不是丢失，而是超出了坐标轴显示的范围，所以导致压在右侧边形成一条粗粗的线段，你可以试试其它分析软件的坐标调整功能，看看能否把这些信号调整出来。
5、不管RFP，只收GFP阳性的话，不做补偿也没关系啊。
6、文献中的门虽然不规范，正确的门应该如下图，但相差不会远，而你的图确实你自己也认识到了，基本上在对角线右下，所以跟文献中的图还是不同的。

椴树

niwanmao 发表于 2014-4-27 20:45
问题好多，我试着一个个回答看。
1、前面的画门考虑确实是根据其表达分布。
2、做双阴性为了电压调节，做 ...

谢谢老师 我每回都以为自己懂了好多 结果一到自己做实验 就发现各种不能理解的问题 深深体会到 流式还是得做得多 见得多 （您说的 我再消化下 有不明白的再来请教您 我上次做完凋亡检测 您也给我解了不少惑 谢谢您 我做流式有了疑问 第一个想到的 就是您这地儿，而不是其他坛子，我觉得 就这一点来说 已经体现了您办这个论坛的意义 帮助大家 互相学习 互相进步）

niwanmao

椴树 发表于 2014-4-27 21:06
谢谢老师 我每回都以为自己懂了好多 结果一到自己做实验 就发现各种不能理解的问题 深深体会到 流式还是 ...

不客气，互相学习。
PS：下次最好加点标点符号和分段，这样看着清楚点：）

PeteM

弱弱地问一句菜鸟低级问题，检测GFP不是应该用FITC？为啥用alaex flour？

椴树

PeteM 发表于 2014-4-28 13:49
弱弱地问一句菜鸟低级问题，检测GFP不是应该用FITC？为啥用alaex flour？

没注意 应该是一样的 你去看看alex fluor 488 http://www.lifetechnologies.com/ ... ary-antibodies.html

niwanmao

PeteM 发表于 2014-4-28 13:49
弱弱地问一句菜鸟低级问题，检测GFP不是应该用FITC？为啥用alaex flour？

通道是一样的，坐标名称是用户自己取的。

猪小乐呀

楼主，倪老师，您好。我想做类似的实验。我的两个荧光是EGFP，另外一个想选dsRFP或者mcherry之一。EGFP通常是488nm激发，FITC通道。另外两个我该怎么选择后续怎么做呢？