实时流式细胞术监测单核细胞固有胞吞作用

niwanmao

胞吞是免疫系统的一种基础生理功能，IgG调理颗粒的胞吞是获得性免疫的重要组成部分，而非调理颗粒的胞吞则在固有免疫中起着关键性作用。
两种胞吞作用均需要通过吞噬细胞表面1种或多种胞吞受体对外来颗粒进行识别，包括Fc受体、补体受体、各种整合素、清道夫受体、最近鉴定出的P2X7 非肌肉肌球蛋白重链IIA复合物（可识别一系列非调理颗粒，例如乳胶颗粒、活细菌、死细菌等）。
许多研究表明，在各种年龄相关疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病中，均存在胞吞作用失效或缺陷。然而，对于定量检测胞吞能力的研究非常少。外周血单核细胞和/或粒细胞是绝佳的胞吞模型，尽管使用荧光标记的乳胶颗粒研究胞吞作用应用了数十年，但还没有一个可靠的定量检测外周血白细胞胞吞能力的方法。

胞吞常用于监测1.0-3.0μm荧光微球或细菌的摄取，但至今还没有可以实时监测颗粒摄取的方法。在此文献中，作者描述了一种两色的实时流式细胞术定量方法，可检测并监测人单核细胞的胞吞能力变化，并对微球类型、数量、温度、缓冲液组成等进行了优化。

本实验采用了3例正常人外周血，采集后用等量PBS稀释，再用Ficoll-Hypaque提取PBMC，用PBS洗涤一次，无血清含Na缓冲液重悬（145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.1% BSA, 5 mM D-glucose pH 7.5 at 37℃)或含K缓冲液（150 mM KCl, 10mM HEPES, 0.1% BSA, 5 mM D-glucose pH 7.5 at 37℃），两种缓冲液中均含0.1 mM Ca2＋。
PBMC先用CD14 APC孵育15分钟（20℃），用含Na缓冲液洗涤，并用该缓冲液重悬，加入900ul预热（37～39℃）Na缓冲液，加入3mm磁力搅拌棒（直径1mm），使得最终体积为1ml。最后将该管子插入Time-Zero系统，使磁力搅拌棒以250rpm速度搅拌（37℃）。包被IgG的YG微球（1um）用于检测胞吞功能，在FACSCalibur开始获取后10～20s加入标记荧光的聚苯乙烯乳胶颗粒（5～10ul），以1000～1500事件/秒的速度获取，至少获取7分钟，保存为FCS2.0格式。

设门图如下：

设门图

针对上图的Time系列图计算每个时间点的曲线下面积（AUC），具体计算公式见PDF正文。最后绘制出时间－胞吞功能曲线图（如下）。

胞吞作用图

文中，作者还进行了微球类型、数量、温度、缓冲液组成等条件的优化测试，找出了最优化的条件，最后同时用Fura Red同时检测了Ca离子内流，protocol见PDF正文。

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2014-6-16 22:14 上传

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dragonhzqsmmu

这个好好学习一下