有没有做过大鼠外周血免疫表型的战友，帮我看下

zark_00

准备做大鼠外周血CD45 CD3 CD4 CD8a CD45RA CD161a，试剂已经订了，今天到货 CD3 CD4 CD8a 和CD161a，打算做个简单的滴定，顺便看看从文献中找出来的样本制备方法到底如何（之前没有做过大鼠外周血，只做过猴外周血和小鼠脾细胞的表型），经一系列操作后，样本上机，FSC vs SSC 图如下，与猴或者人外周血表型分析中 FSC VS SSC 图差异较大。请做过大鼠外周血免疫表型的战友，发张FSC VS SSC的图上来，我对比下，万分感谢。
找遍了 pubmad ，没搜到 rat immunophenotyping 等主题的文献，无奈便结合 BD 官网的大小鼠多色表面染的步骤和自己之前的类似经验，攒了一个样本制备方案，发现：用BD的裂解液，15分钟室温裂解2ml：100ul全血，再加上5分钟离心，共20分钟的裂解液接触，等离心洗涤2次结束后，还是有红细胞存在，而且是同一份血样分出的几个管，其中有红细胞残留多的，也有残留少的（一样的处理一样的样本）。上机后，估计白细胞损伤也有点大，图像没法看了。在此请问大家有没有确实做出不错结果的方案或文献，分享下，谢谢。

我的方案如下：100ul全血+适量staining buffer（biolegend）+4ul purified CD32(BLOCKING) 孵育5分钟4度。
                        再加适量抗体 室温避光孵育30分钟
                        加入2ml 1X 裂解液（BD) 15分钟，不加buffer终止，直接常温350g离心5分钟
                       弃上清，加2ml stainingbuffer重悬，常温350g离心5分钟
                      弃上清，加0.5ml stainingbuffer重悬，冰上避光待测。

niwanmao

CD3、CD4、CD8没有标吗？反设门看看就知道了。而且，我觉得是不是因为标本不新鲜或者处理的缘故，按道理不同物种外周血基本的分群应该差不多的。

zark_00

niwanmao 发表于 2014-7-25 21:27
CD3、CD4、CD8没有标吗？反设门看看就知道了。而且，我觉得是不是因为标本不新鲜或者处理的缘故，按道理不 ...

这张是做CD3 4 8 滴定时附带做的阴性对照样，主要就是来看分群情况的。结果跟猴或人的图差距不小。

样本是今天上午采的大鼠眼眶血，EDTAK2 抗凝，拿到血后，看不出来有凝血现象（凝血有影响么，不是成块的那种显著凝血，而是凝血早期），而且在4度冰箱里保存的，样本开始处理时，血离体没超过2小时

niwanmao

zark_00 发表于 2014-7-25 21:37
这张是做CD3 4 8 滴定时附带做的阴性对照样，主要就是来看分群情况的。结果跟猴或人的图差距不小。

样本 ...

可以根据染CD3、CD4、CD8的标本定细胞群性质。

zark_00

niwanmao 发表于 2014-7-25 22:07
可以根据染CD3、CD4、CD8的标本定细胞群性质。

今天带回了部分的图，倪老师帮忙看看，都是单染

niwanmao

zark_00 发表于 2014-7-25 22:16
今天带回了部分的图，倪老师帮忙看看，都是单染

CD4的反设门你没有标示出来，但我感觉应该是如下分群：

zark_00

找到现在，还是找不到文献，哪怕是中文的，哎~

niwanmao

zark_00 发表于 2014-7-27 18:29
找到现在，还是找不到文献，哪怕是中文的，哎~

肯定跟其它物种一样的啊，你看：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2676340/figure/F2/ 第2幅图。
所以我估计跟你标本处理不当导致淋巴细胞弥散有关。

zark_00

niwanmao 发表于 2014-7-27 19:48
肯定跟其它物种一样的啊，你看：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2676340/figure/F2/ 第2幅 ...

谢谢倪老师，这下有底了。估计也是样品处理的问题，
明天要讲PPT, 看来时免不了挨骂了~~~