流式测凋亡前标本处理问题？

Doctor-Lulu

新手求指教：下面3个图分别是流式检测凋亡时的空白组、单标组及实验组。1x10^6个细胞从培养板中取出后，空白组（图1）1000rpm 8min离心过一次，单标组（图2）及实验组（图3）继续用1200rpm 5min处理过两次。结果发现貌似细胞碎片和杂质更多了，而且单标组和实验组的细胞减少了许多，甚至不足10^4个。请问：这种现象的问题在哪？该如何解决？谢谢~

niwanmao

单标和实验管细胞是不是经过同样的药物处理？

Doctor-Lulu

niwanmao 发表于 2014-8-26 07:29
单标和实验管细胞是不是经过同样的药物处理？

单标组没有用药物处理，只是单纯的加了荧光染料

小灰

你有个误区。离心机使用是看离心力而不是转速，不同离心机相同转速，离心力可以差很多。过高的离心力会让状态不好的细胞破裂。
你可以把空白组1000RPM离心一次为一组；1000rpm离心然后1200rpm离心两次为一组，看看是不是会出现你图上的区别。确定是不是离心引起的。
有些药物对细胞有毒性，会使细胞变得脆弱，离心力没控制好就会让实验失败，所以你首先要排除是不是离心力选择不准确

桃小丁

倪老师这个门圈的没有问题吗？@niwanmao

niwanmao

桃小丁 发表于 2014-8-26 10:40
倪老师这个门圈的没有问题吗？@niwanmao

后面两个图的左侧是凋亡、碎片细胞，凋亡细胞得看情况确定圈还是不圈。

Doctor-Lulu

小灰 发表于 2014-8-26 10:24
你有个误区。离心机使用是看离心力而不是转速，不同离心机相同转速，离心力可以差很多。过高的离心力会让状 ...

谢谢提醒！在实验室，常听到大家用转速来描述条件，所以没有注意。其实，之前只考虑着细胞损失太多，然后拿未做任何处理的相同细胞（即和空白组一样）做了质控，加大离心力1500rpm（不知道我们的离心机这个转速对应着多大的离心力^-^） 5min 升9降6，处理3次，发现最后细胞碎片和杂质并没有增多（见图abc)。所以，现在困惑了，之前实验时的细胞碎片和杂质怎么产生的？

桃小丁

niwanmao 发表于 2014-8-26 13:49
后面两个图的左侧是凋亡、碎片细胞，凋亡细胞得看情况确定圈还是不圈。 ...

这个情况是怎么说呢？楼主不就是要测的凋亡吗？

小灰

Doctor-Lulu 发表于 2014-8-26 14:30
谢谢提醒！在实验室，常听到大家用转速来描述条件，所以没有注意。其实，之前只考虑着细胞损失太多，然后 ...

几个方面：
    取样时候细胞状态如何？镜检一下，一般长到60到70%来做凋亡实验。
    加药物后对细胞状态有没有很厉害的影响。列如贴壁细胞漂浮起来，比例很高等等
    取样后细胞离开培养环境到上机是不是隔了很多时间。离开培养环境时间久了，细胞本身状态会影响

Doctor-Lulu

小灰 发表于 2014-8-26 14:55
几个方面：
    取样时候细胞状态如何？镜检一下，一般长到60到70%来做凋亡实验。
    加药物后对细胞状 ...

看来我有好些细节没有注意到。还请问您，CD4+T细胞离开培养环境1个半小时左右对状态影响大吗？