细胞培养后门控问题

futiger

培养了一段时间的人外周血细胞做双标的流式检测，散点图如图1，用双标的抗体检测，设门选择的不同表达结果不同，A为53.5 双阳性为41.1，  E为35.8双阳性为10.5  G为 96.9双阳性为 27.5，问题1 ：是不是说明A区和E区是两群细胞（因为增殖周期不同或者分化不同）但是两群细胞都有双阳性的表达，还是还是一群细胞只是有碎片或者不均一导致的；

问题2：如果我想看双阳性的表达是选A区还是E区还是G区更好呢？

G区

E区

didi_zhou

不知道你原始的划门依据是什么，从这几张图来看，电压不是最好，PE电压偏低，左边明显的贴边。另外流式划门以群为标准，不是一定以第一象限，你的划门依据不是很明显，十字门的FITC应该划在10^1左右比较合理。

A\E的区别应该是活细胞和死细胞+碎片，你可以用PI或者DAPI去区分一下。你把门重新画一遍（上面说到的位置）就知道E其实主要是双阴性的。如果不用PI或DAPI区分死活细胞的话主要就分析A群就好了。

niwanmao

你能否先说明一下你要圈哪一类细胞（例如粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）。

futiger

didi_zhou 发表于 2014-9-11 19:55
不知道你原始的划门依据是什么，从这几张图来看，电压不是最好，PE电压偏低，左边明显的贴边。另外流式划门 ...

谢谢您我用的机器原来的protocol
FS  484  2.0
SS  334   20
FL1 875  1.0
FL2 619  1.0
我回头再调一下电压改到750试试
十字门我是用阴性细胞调的，这个应该是不变吧，还是没做一个都得重新调节啊？
E区应该是细胞碎片一类的，但是我就想知道为什么碎片区内也有双阳的表达啊，而且因为化区的不同比如说A区E区以及G区导致了双阳性的细胞比率不同了，那是应该选精确点好呢还是都选上好呢？
再次感谢您的答复O(∩_∩)O谢谢

futiger

niwanmao 发表于 2014-9-11 21:29
你能否先说明一下你要圈哪一类细胞（例如粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）。 ...

倪老师这个是外周血分离后经过DC贴壁后剩下的混合细胞，我培养了几天，用CD3，CD4标了一下O(∩_∩)O~，A区里应该含有TBNK以及少量的巨噬细胞之类的吧，还是说应该是A区里是T细胞G区里含有其他的呢(⊙o⊙)？

niwanmao

futiger 发表于 2014-9-11 22:03
倪老师这个是外周血分离后经过DC贴壁后剩下的混合细胞，我培养了几天，用CD3，CD4标了一下O(∩_∩)O~，A ...

不知道你染的FITC和PE分别是什么标记？
但我总觉得设门应该设成如下的：

futiger

niwanmao 发表于 2014-9-11 22:21
不知道你染的FITC和PE分别是什么标记？
但我总觉得设门应该设成如下的：

哦是不是得这样理解，十字门的话也是看图像中各自的分群来定的（如果分群明显的话），如果分群不明显的话就得用阴性对照来确定，我这个是用以前的阴性对照作为阴性门设的，是不是在每个标本检测前都得再重新做一次啊忘了写了CD3-PE的CD4-FITC的

didi_zhou

futiger 发表于 2014-9-11 22:48
哦是不是得这样理解，十字门的话也是看图像中各自的分群来定的（如果分群明显的话），如果分群不明显的话 ...

你说的阴性对照是指unstain吧？这个概念是错误的。阴性群是指常规染色后只有阴性细胞群的细胞，Unstain是指没有染色的细胞。由于细胞黏性和非特异性染色原因，两者的荧光荧光表现是不一样的。一般我们会用同型对照来染色做阴性对照，也就是用来调电压。
如果你没有同型对照，且已知的被测指标有明显的阴阳性群的话（像CD3\4\8之类的会非常明显），你可以用单染来调电压，其实这样比同型对照更准，就是要一个一个管调，稍微麻烦一点，不过你就做2色，不会麻烦到哪里去。
具体做法你可以用FITC单染管调FITC的电压、PE单染管调PE的电压，以此类推，只调电压不调补偿。所有管都调完了以后再重新按顺序上样调补偿。虽然麻烦，结果会很准确。如果是比较严谨的做法，每次实验、每批样品都应该这样做，特别是培养的细胞，毕竟会有抗体效价、细胞状态和种类的不同。这样也会解决你划门的问题。

E区除了有细胞碎片（SS比正常细胞小的），还有膜结构不完整的死细胞（SS跟A一样或偏大的），所以有些阳性细胞在里面很正常。分析的时候不应该包含在里面。

wwyangxu

细胞的大小和FS有关，还是和SS有关，应该是FS吧

futiger

didi_zhou 发表于 2014-9-13 00:11
你说的阴性对照是指unstain吧？这个概念是错误的。阴性群是指常规染色后只有阴性细胞群的细胞，Unstain是 ...

(⊙o⊙)哦明白了感谢