为什么每个标本都有一个不明原因的小峰？

cellprobe

我的实验设计：从老鼠接种瘤中分离单个细胞，用FACS检测抗原PMSA的表达。PMSA的抗体是PE标记的。

第一次：分离得到的细胞存活率是90%，直接染色上机。

第二次：分离得到的细胞存活率是90%，抗体染色，上级前样品加7AAD。先做荧光补偿，再收集数据。用7AAD阴性设门去除死细胞。在7AAD阴性群落里面用直方图判定PMSA是否表达。

结果：两次实验中，无论是否加7AAD，都一样。每个直方图背景都是很高，在每个主峰前面都有一个小峰。我开始以为小峰是死细胞非特性染色造成；用7AAD去除7AAD阳性细胞群落后，发现小峰仍然存在，几乎每个sample都有。请高手指教。谢谢

niwanmao

cellprobe 发表于 2014-10-15 21:24
您是这个意思吧：先设置7AAD/FSC的散点图，圈7AAD阴性的细胞群R1。然后在R1里面圈FSC和SSC都很大并且不在 ...

你不知道非特异性荧光和死细胞基本上都是位于对角线上？
碎片和非特异性荧光排除掉，剩下的才是真正的活细胞。
仔细揣摩一下

cellprobe

就是用IgG control染色或者仅是用二抗染色，都会出现很奇怪的小峰。

cellprobe

我上传raw data。谢谢

niwanmao

cellprobe 发表于 2014-10-15 20:18
我上传raw data。谢谢

我估计你前面所说的活力好的细胞90％以上是染色前吧，但在流式上却不是这样的，虽然7-AAD阴性的细胞确实有90％左右，但在FSC/SSC散点图上，FSC和SSC均特别小，提示可能是碎片为主，所以应该如下面所示的圈门。

cellprobe

请倪老师能详细的说几句，怎么分析吗？怎么去除细胞碎片和死细胞啊？非常感谢啊。

cellprobe

倪老师，细胞活力是90%，是指在抗体染色之前计算得到的。我是用Flowjo分析的。我先设门去除左下角的细胞碎片，然后再设门去除7AAD阳性的死细胞。您用的软件可能比较高级。而且我恳请你把分析步骤详细的说一边，因为很多东西我不懂。谢谢

niwanmao

cellprobe 发表于 2014-10-15 20:59
倪老师，细胞活力是90%，是指在抗体染色之前计算得到的。我是用Flowjo分析的。我先设门去除左下角的细胞碎 ...

采用哪个步骤无所谓，我是这么设的，首先圈7-AAD阴性的细胞（可以用直方图，也可以用我这里演示的7-AAD/FSC），然后再圈P2这种FSC和SSC大并且不在对角线上的细胞，最后显示P2内的细胞表达情况。

cellprobe

niwanmao 发表于 2014-10-15 21:12
采用哪个步骤无所谓，我是这么设的，首先圈7-AAD阴性的细胞（可以用直方图，也可以用我这里演示的7-AAD/F ...

您是这个意思吧：先设置7AAD/FSC的散点图，圈7AAD阴性的细胞群R1。然后在R1里面圈FSC和SSC都很大并且不在对角线上的细胞P2，最后用直方图分析此细胞群的表达，M3。
可是FSC和SSC都很大的细胞很多，为什么你只圈了17.63?
不在对角线上是什么意思？
您是用kaluza分析的吗？

cellprobe

倪老师，在此刻之前，我并不知道：死细胞和非特异性细胞是位于FSC/SSC散点图的对角线上。您告诉我的这条意见我觉得非常重要。可是正方形的对角线有两条啊，，，，，怎么区分？
最后一个问题：在您给我的三幅图中的中间那幅FSC/SSC散点图中，P2是画在右下方，如果P2画在左上方是不是也可以？