用贝克曼（beckman）流式做ROS和JC-1检测的问题咨询

asige135

大家好，我们部门用的是beckman细胞仪，型号是EPICS, XL-MCL,这款仪器比较便宜，做的结果不知道为什么也总是不尽人意，我是这台仪器的小主管，我不知道是不是自己的技术有问题，希望有了解的给予帮助，谢谢。先来说说这两天做的ROS和JC-1检测。

1、ROS检测
实验：为了调试机器，我们只用了正常组和阳性组。图1：ROS检测
问题：我是先用阳性对照调的电压，然后再上正常管的细胞，为什么我的正常管的峰却比阳性组的峰更靠右呢？还有，阳性对照有两个峰应该是正确的吗？我们经常遇到这样的问题，比如之前做过的细胞周期，用调零孔设置好了电压，使正常细胞峰的两个边脚落在左边，等一上加药管的细胞，整个峰都向右平移了一大格，我们问工程师，工程师总说是我们没调好，后面他自己来做了一下，好像也有这个问题，又用其他理由搪塞掉了。这个问题困扰我们很久了，希望懂得的老师帮帮我们。
2、JC-1检测
实验：为了调试机器，我们只用了正常组和阳性组。图2：JC-1检测
问题：图1中，我是先用正常组来调电压和补偿，跑出的结果为图2中的1图，保存程序后，我再上阳性管，就完全找不到细胞了，只有图的顶上一点有一些细胞，应该都是跑出去了，为什么呢，明明都调好电压和补偿了，因为看不到什么细胞，阳性结果我就没保存。然后我进行了第二次调电压，这次我就先用阳性管调，如图2中的2图，感觉还算 好看，于是重新保存程序后，我再上正常管，就又跑成图2中3图所示，真的是要疯掉了，这是为什么啊，求求各位大侠帮忙啊。

是我们机器的问题吗，真的是超级郁闷，我都开始怀疑是不是自己操作的问题了。在这个交流网站上，我看到的大部分都是BD流式的交流，心情更是郁闷，难道beckman没有BD好吗？

hjzhao

ROS实验注意事项：

（1） 处理过程绝对避光；

（2） 染料与细胞混合时间要充分，每隔3-5min晃动一次；

（3） 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，PBS洗一遍可能不够，最好洗个2、3次，以去除未结合的探针，否则会导致背景较高；

（4） 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差；

（5） 细胞应保持良好的活性状态。贴壁细胞培养时不应超过瓶底面积的75%，悬浮细胞培养时其数目不能超过5×105/mL；贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速，避免产生过多的细胞碎片

（6） 使用流式细胞仪要确保细胞分散开（在与染料混合和处理时）

（7） 流式细胞仪对细胞数目有一定的要求，一般为106，可以使用六孔板

以前做过ROS检测，阳性只有一个峰，应该是整体峰向右移，荧光强度增强，所以先看下你的实验过程是否有问题。

hjzhao

而且调节电压，应该是用阴性细胞（即无装载探针或染色的细胞）调节

niwanmao

1、ROS你们用什么染料？DCFDA?
2、正常组的JC-1确定标记了？
3、两个实验中的正常组和实验组的细胞密度在染料前是否调整一致了？

最后，这里关于Beckman的机器讨论也是不少的，只是相对偏少，这是因为流式细胞仪市场决定，目前的市场上BD和Beckman仪器大约为7：2

asige135

hjzhao 发表于 2014-11-17 15:55
ROS实验注意事项：

（1） 处理过程绝对避光；

谢谢你，看了你的建议，我们再好好试试。

asige135

niwanmao 发表于 2014-11-17 21:46
1、ROS你们用什么染料？DCFDA?
2、正常组的JC-1确定标记了？
3、两个实验中的正常组和实验组的细胞密度在染 ...

1 ROS是用的DCFDA
2 JC-1的正常组是否标记了，我还真的没有来确定，因为样本是别人处理的，我再来确定一下。
3 两个组的细胞密度如果不一样出来的图会怎么样呢？我们重来都没有调过细胞的密度啊。

谢谢倪老师，我们下次做来调一下细胞密度。

asige135

hjzhao 发表于 2014-11-17 16:00
而且调节电压，应该是用阴性细胞（即无装载探针或染色的细胞）调节

我们也知道，电压调节确实也是要用阴性细胞，但是之前工程师跟我们说，也可以用阳性组来调的，所以我们经常是两个组都来试试。

niwanmao

asige135 发表于 2014-11-18 09:24
1 ROS是用的DCFDA
2 JC-1的正常组是否标记了，我还真的没有来确定，因为样本是别人处理的，我再来确定一 ...

DCFDA做ROS，阳性组应该是荧光强度增高才对，怎么还会出现一个阴性峰呢？是不是跟设门或处理有关？

其它两个问题，我建议你先调整细胞密度试试，然后再在操作时注意各种试剂不要加错或漏加。一般问题不大。

燕仔zoe

asige135 发表于 2014-11-18 09:26
我们也知道，电压调节确实也是要用阴性细胞，但是之前工程师跟我们说，也可以用阳性组来调的，所以我们经 ...

ROS我们有时候也会有两个峰，通过反圈看出，左边那个峰一般出现在FSC偏左、SSC偏上位置，我个人估计是凋亡或即将凋亡的一批细胞，所以后来我们一般就会选择在设门的时候剃掉这一小群细胞，不过存在两个峰的情况一般是出现在实验组中，ROS的阳性我没做过，我只拿阴性来调电压，所以不知道是不是ROS阳性的细胞群，凋亡这一块特别多，才导致左锋的存在。
另外想请教一个问题，JC1你们是怎么调补偿的？有时候我们调好一管的补偿，然后在同一组specimen中都采用同一补偿值，但是就是觉得有些就补偿过了，有些还欠缺，请教在同一specimen中可以采用不同的补偿值吗？同时，请教倪老师 @niwanmao 老师~

niwanmao

燕仔zoe 发表于 2014-11-18 17:11
ROS我们有时候也会有两个峰，通过反圈看出，左边那个峰一般出现在FSC偏左、SSC偏上位置，我个人估计是凋 ...

原则上当然不可以，但是对于这些分群明显的，为了美观起见，补偿允许一定程度的波动。