IL-17流式检测

yurain2002

我最近在做人外周血IL-17的流式检测，选择的是EB公司的Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500x)和APC标记的IL-17抗体，具体方法是将提取的PBMC用含20%胎牛血清的RPMI1640调整为1x10 6/ml，加入24孔板中，每孔液量1ml，加入刺激剂2ul，分别刺激5小时和7小时，后续加入CD3、CD4、CD8抗体，固定穿膜60min后加入IL-17抗体孵育45min，1%多聚甲醛固定保存于第二日上机检测，IL-17无阳性。
想请教各位老师，1）EB公司的Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500x)试剂我使用方法是正确的吗？如果不妥，应该怎样调整？2)关于IL-17的流式检测，有哪些需要注意的地方？
谢谢！

v2002lichao

不知道你用的是什么刺激剂？

niwanmao

以前有过类似讨论，条件还是需要摸索的，可以参考这个帖子中链接的资料：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3445-1-1.html

yurain2002

v2002lichao 发表于 2014-11-20 18:22
不知道你用的是什么刺激剂？

EB公司的Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500x)

yurain2002

niwanmao 发表于 2014-11-20 20:27
以前有过类似讨论，条件还是需要摸索的，可以参考这个帖子中链接的资料：http://www.flowcyto.cn/bbs/threa ...

谢谢倪老师！今天又做了一次，IL-17有阳性了。再摸索摸索，应该会更好的。

niwanmao

yurain2002 发表于 2014-11-20 22:58
谢谢倪老师！今天又做了一次，IL-17有阳性了。再摸索摸索，应该会更好的。 ...

为您点赞。有些实验没有办法，因为是个性化的，只能根据检测结果慢慢摸索条件。

yurain2002

谢谢倪老师的鼓励！

Linda

yurain2002 发表于 2014-11-20 22:58
谢谢倪老师！今天又做了一次，IL-17有阳性了。再摸索摸索，应该会更好的。 ...

你好，不知道你做的IL-17现在做得怎么样了，可不可以分享一下你的实验步骤和心得？我最近也在做这一块，但结果不理想。。。

yurain2002

Linda 发表于 2014-11-27 11:22
你好，不知道你做的IL-17现在做得怎么样了，可不可以分享一下你的实验步骤和心得？我最近也在做这一块， ...

我最近也咨询了有关IL-17的流式方法。结果不理想与刺激关系较大。细胞需要充分刺激才能较好测出细胞内因子。刺激效果如何，可以选择CD69检测，大于90%才说明刺激效果理想。我以前也不知道这些，最近听课才明白的。但还未付诸实施。你可以试试。

niwanmao

yurain2002 发表于 2014-12-6 10:06
我最近也咨询了有关IL-17的流式方法。结果不理想与刺激关系较大。细胞需要充分刺激才能较好测出细胞内因 ...

关于刺激效果站内N年前就有资料提到了，经常要注意挖宝藏啊。