急求。。Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞的问题

钢蛋儿

各位好：由于实验需要，需要同时用Annexin V/PI和CD3/CD8标记PBMC。因为Annexin V标记时的缓冲液是含钙离子试剂盒配套的Binding buffer，想请问两种方法：
方法一（确定可以的，因为听说有人做过）：先在PBS中标记CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中标记Annexin V。最后洗去并标记PI，上机检测。
方法二：将CD3/CD4，和Annexin V同时在Binding buffer（含钙离子）中标记。孵育好之洗去抗体，然后标记PI，上机检测。
请问方法二可以吗？
谢谢大家。

niwanmao

建议用方法一。

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-11-20 07:22
建议用方法一。

谢谢。有人做过Annexin-v、PI与胞内因子共染色的吗？

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2014-11-20 17:24
谢谢。有人做过Annexin-v、PI与胞内因子共染色的吗？

你这样做不太好，胞内因子需要破膜，肯定要影响膜的完整性。不建议同时做。

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-11-20 19:45
你这样做不太好，胞内因子需要破膜，肯定要影响膜的完整性。不建议同时做。 ...

谢谢，确实，由于经过了固定破膜步骤，PI或7-AAD染色后所有的细胞都
是阳性，所以PI或7-AAD只适合于胞膜染色的死活细胞鉴定
刚刚在网上看到一款可固定的死活细胞鉴定染料Fixable Viability Dye，它主要是一种氨基反应性染料，可与细胞表面或者内部的蛋白不可逆的结合。因此不受胞膜、凋亡Annexin、胞内染色的干扰。

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2014-11-20 21:07
谢谢，确实，由于经过了固定破膜步骤，PI或7-AAD染色后所有的细胞都
是阳性，所以PI或7-AAD只适合于胞膜 ...

好像是Life公司出的吧 ，那种可以试试。

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-11-20 21:09
好像是Life公司出的吧 ，那种可以试试。

我看到的是ebioscience公司。可能其他公司也有，但感觉蛮陌生，具体怎么样我还没有查文献呢

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2014-11-20 21:41
我看到的是ebioscience公司。可能其他公司也有，但感觉蛮陌生，具体怎么样我还没有查文献呢 ...

可以试试，只要不涉及到胞膜，我觉得可以跟胞内因子一起染色

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2014-11-21 09:19
可以试试，只要不涉及到胞膜，我觉得可以跟胞内因子一起染色

谢谢倪老师！