请教Treg的CD4分群和foxP3设门问题

高医生

各位前辈，最近在做Treg的流式检测，用的是美天旎公司的试剂盒，CD4-FITC,CD25-PE,FOXP3-APC,做出来结果分群不明显，分析数据时遇到些疑惑。向各位前辈请教一下，先放几张图，有两个问题，1.第一张图FITC分了三群，正常不是应该两群的吗？和抗体孵育时间有关吗？2.第三张图十字门的横纵左边怎么确定，我做了空白以及单染的对照，依据空白的阴性画的门，但每个样品差异特别大，请问各位前辈在这种分群不明显时是怎么确定十字门的横纵坐标的？
谢谢各位前辈

CD4分了三群，是因为抗体孵育的时间长了吗

这个十字门的横纵坐标怎么确定啊？我做了单染和空白的对照，根据它们的阴性画的十字门，但是每个标本之间差 ...

niwanmao

CD4分得不好，可能跟你没有进行抗体滴定有关，也可能跟你的抗体质量有关。

第三张图的画门应该画那群右上角突起的部分，不要怀疑，就用不规则门，而不是十字门。

高医生

谢谢倪老师的指点，还有3个问题，
1.那画不规则门的话，岂不是主观性更强了，画多大的区域怎么确定？
2.你们做的CD4阳性的一般占到多少比例？
3.算Treg占PBMC的比列是不是Treg/PBMC=CD25及FOXP3双阳的乘以CD4阳性的细胞比例
谢谢老师

niwanmao

高医生 发表于 2014-11-24 22:52
谢谢倪老师的指点，还有3个问题，
1.那画不规则门的话，岂不是主观性更强了，画多大的区域怎么确定？
2.你 ...

1、不规则门和十字门一样，都是门的一种形式，如果你认为不规则门主观性强，十字门难道就不强？只要分群还可以，主观性就不会影响。你这个图分群还是不错的。
2、CD4的阴性率不一定，关键是分群分得开，这样才说明抗体效价好。
3、应该是最后的双阳性细胞量除以活力好的PBMC数量。

v2002lichao

niwanmao 发表于 2014-11-25 10:32
1、不规则门和十字门一样，都是门的一种形式，如果你认为不规则门主观性强，十字门难道就不强？只要分群 ...

倪老师，同一管抗体，染细胞，第一天挺好，第二天就不分群了，原因可能是什么？细胞没问题。我提的原代淋巴结细胞和脾细胞。淋巴结细胞不分群，脾细胞分群，但是CD4阳性峰比之前低很多。

niwanmao

v2002lichao 发表于 2015-6-12 23:13
倪老师，同一管抗体，染细胞，第一天挺好，第二天就不分群了，原因可能是什么？细胞没问题。我提的原代淋 ...

细胞来源不同、活力不同，染色之后的效果也不同。这是正常的。但一般不会相差太大，如果相差太大，就需要注意是不是某管细胞太多了。