关于AV/PI检测凋亡的问题

hexia472382381

新手，这几天在做这个双染检测凋亡的实验，有几个问题，希望老师能给我指导

1. 我用的BD的试剂盒，100test的 Annexin V-FITC 500ul，但是PI为什么有2ml？ 这个PI的浓度和细胞周期用的PI浓度又不一样，能用于细胞周期么？
2. 我做的细胞中有一个细胞是半贴壁的，悬浮细胞收集回来后，用不含EDTA的胰酶消化的时间非常长，将近10分钟，这么长的时间对细胞影响大么，能不用胰酶，直接刮刀刮下来么？

3. 我的仪器是BD 的FACScalibur，FL1通道似乎有问题。表现为： 用FITC单染和双染sample，都会在对角线出现信号，补偿调的很高也下不来，而PI单染正常，凡是有FITC的sample在FITC-PI散点图中，双阴信号群相较于空白和PI单染sample都会往左边偏移，右下角也就是早调区域是没有信号的。不知道为什么

niwanmao

hexia472382381 发表于 2014-11-26 20:35
新手，这几天在做这个双染检测凋亡的实验，有几个问题，希望老师能给我指导

1. 我用的BD的试剂盒，100test ...

1、ANNEXIN V/PI试剂盒里面的PI和细胞周期中的PI浓度不同，而且染液的成份也不一样，不能通用。细胞周期的PI染液可以自己配制，详见站内自己搜索“周期”。
2、无论是胰酶还是刮刀，都会造成细胞损伤。所以不知道你们贴壁的细胞为什么都这么喜欢用AV/PI。其实对于贴壁细胞，最好的就是检测胞内指标或细胞周期。
3、如果补偿值调的很高都下不来，那就说明这些是非特异性荧光，往往与细胞死亡有关。

综上，建议你还是用subG1和一些胞内凋亡指标（如caspase-3、线粒体膜电位等）代替AV/PI。

hexia472382381

niwanmao 发表于 2014-11-26 21:00
1、ANNEXIN V/PI试剂盒里面的PI和细胞周期中的PI浓度不同，而且染液的成份也不一样，不能通用。细胞周期 ...

首先，谢谢老师的及时回复
我就是好奇，给我们过量的PI有何意图没有
我那个细胞贴壁的只占总细胞的将近20%，能否舍弃这些细胞，只检测悬浮的？
为什么会偏移？ ？

niwanmao

hexia472382381 发表于 2014-11-26 21:06
首先，谢谢老师的及时回复
我就是好奇，给我们过量的PI有何意图没有
我那个细胞贴壁的只占总细胞的将近20 ...

AV/PI中的PI是稀的，不是过量。

是否只测悬浮的得看你的细胞是否悬浮状态也是好的，如果悬浮也是正常的，可以只收集悬浮的。

偏移的话你把FL1减小不就行了？