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当我们学习荧光时，第一件学到的事情就是荧光素吸收光子之后，会释放出更高波长的光子。该特性被称为斯托克斯位移。
【流式中文网注释】
1852年Stokes阐明了荧光发射的机制。激发峰位和发射峰位的波长之间的差是一个表示分子发光特性的物理常数，这个常数被称为斯托克斯位移（Stokes shift)。它表示分子在回到基态以前，在激发态寿命期间能量的消耗。
荧光光谱较相应的吸收光谱红移，这被称为斯托克位移（Stokes shift）。荧光光谱发生向短波方向的位移被称为反斯托克位移（anti-Stokes shift）。
由于光子被荧光分子吸收后，其中部分能量会在分子振动和移动时被损失掉，所以最后释放出的能量会小于吸收的能量。因为波长与能量成反比，所以释放的能量越低，波长越长。
因此，检查一个荧光分子的激发和发射波长非常重要，下图（图1）显示了FITC荧光素在488nm激发光下的激发和发射波长分布情况：
图1
图1. FITC的发射波长最大值约530nm，这意味着如果激发FITC，那么它发射绿色光子的可能性非常大，所以，我们在流式细胞仪上选择适合该波长区域的带通滤镜（如525/30），以捕捉这些绿色光子。
然而，FITC的发射并不仅仅限制于绿色光子，它也可能发射黄色、橙色、红色光子，尽管概率较低。
如果你仔细观察上面这张激发和发射曲线图，就会看到一些奇怪的现象，就是在发射曲线上，有少量光子的发射波长甚至比激发波长还低（就是绿色峰在488nm左侧的部分，虽然比例很低），这意味着释放的光子能量比激发光子还高？如果这样的话，说明释放出的能量比荧光素吸收的能量还高，这不是违反了能量守恒定律吗？
PE可被两个波长段的光所激发，如图2所示，图2下方第二个波长段的光谱分布图更明显地提示了这个异常现象。
图2
图2. PE的激发情况被FITC更复杂，它有两个激发最大值：一个大约在488nm，一个大约在561nm。有趣的是，在561nm激发时，部分发射光子的能量比吸收光子更高，此异常现象比FITC更明显。
如何既不违反相当成熟的通用定律，又能够完美的解释这一诡异现象呢？
答案很简单：荧光分子自己提供了部分能量。
参见Howard Shapiro所著的Practical Flow Cytometry第113页：
“好吧，你可能会说，激发光谱和发射光谱是重叠的，这就意味着在重叠区域内，不管用什么波长的光去激发，都可能获得更高能量的光子（如510nm激发获得一些500nm光子），这明显违反了能量守恒定律。确实，如果在510nm光子激发荧光素之前，荧光素分子就已经处于振动激发态，那么我们还真的能够从510nm激发获得500nm的光子，这里分子自身提供的能量导致了这一诡异现象的产生。”
到这里，你就明白了，这个奇怪而又常常被误解的现象是真实存在的，更重要的是，它并没有违反物理学定律。
在FITC和PE同时检测时，如果使用宽带通的滤镜（例如用525/50 BP代替525/30 BP），那么你就会注意到这个现象特别明显。在FITC PMT中看到的任何PE信号均不依赖于激光器，也就是说，不管你用488nm激光还是561nm激光激发都可以看到这些奇怪现象。
注意：以上低能向高能位移（反斯托克位移）的现象只出现在488/561共轭系统，这种光路系统中两根激光的发射光通过同一条光路收集。多点或多孔（Multi-spot or multi-pinhole）的仪器则没有FITC滤光片。
实际上，如果你用561nm激发，你会在FITC看到更多的PE信号，因为PE分子在561nm的激发效率比488nm还要高，最关键的是发射曲线形状与激发波长无关。
所以，“荧光素发射的光子波长肯定比吸收的光子要长”的表述是错误的，更准确的表述是“荧光素根据发射光谱发射光子，其发射光最大值会向高波长位置移动，且大于激发光的最大值”。今天这里讲到的现象提醒我们，荧光素远比我们想象的要复杂，但实际上，也是非常有趣的一件事情。
参考资源：
1. BD Fluorescence Spectrum Viewer的波长光谱数据
2. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons. 2003.
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发表于 2015-1-8 10:13:43
发表于 2015-1-8 17:00:02
