免疫表型：细胞世界的“通讯录”

niwanmao

搞清楚什么是什么
当研究细胞和细胞亚非群时，我们需要对每个细胞进行身份确定和分类，从而能够确定某个群体的细胞性质，帮助我们了解其在健康和疾病中的作用。流式所做所为的就是寻找细胞表达的蛋白（通常在表面，有些在胞内），用术语来说就是“免疫表型”。


免疫表型的原理
了解细胞性质最直接的方法就是利用抗体结合感兴趣的蛋白。因为特定的蛋白可表达在多种细胞上，所以我们经常需要同时检测多种蛋白。那么哪种技术最适合呢？流式细胞术可以同时检测单个细胞的多个参数，每秒钟可以检测成千上万细胞，这么完美的搭配，不选流式还选谁呢？

目前流式有大量的试剂可供选择，你可以选择各种荧光素标记的单克隆抗体，检测你要寻找的细胞亚群。不过为了使检测更有效率，你需要在检测之前花点时间来确定你要使用哪些抗体来检测你的目的细胞、用什么荧光素能够在混合抗体中表现更好、你的仪器允许你使用什么荧光素等等。一定要确保你使用的流式细胞仪能够检测你的荧光素，例如没有配置红色激光，就意味着没法检测APC荧光素。



细胞表面的CD分子
对于要检测的蛋白，多数情况下指的就是CD标记（细胞分化簇）。CD分子多为细胞表面蛋白，主要参与细胞通讯、代谢或粘附。每隔数年，就会有一群专业人士聚在一起，讨论这些蛋白及其功能，讨论蛋白属于何种细胞，最后对它们进行归类，目前这张表格中已经有超过330个CD分子（截至2014年11月）。我们经常通过CD标记和细胞的前向、侧向角区分不同细胞，有些细胞通过一个或两个标记就区分开来（如CD19+ B细胞，CD3+CD4+ 辅助T细胞），但有些则比较复杂，需要一起检测许多标记，然后根据其表达水平进行明确（例如人中性粒细胞表达特点为CD15+, CD16high, CD14lowCD52low）。

免疫表型散点图示例

免疫表型散点图示例：
A：通过FSC和SSC分出淋巴细胞（ii），然后就能简单区分T细胞（蓝色，CD3+）和B细胞（紫色，CD19+）（i）。
B：区分嗜酸粒细胞（红色，SiglecF+  F4/80 int CD11b int  Ly6G-/low CD11c- FSC low SSC int/hi
（注：SiglecF抗体不能用于细胞分选，因为该抗体可诱导细胞死亡！）
所有散点图检测的标本来自于小鼠腹腔渗出细胞。


细胞表面以下
跟细胞表面标记一样，我们也可以使用胞内染色了解一下细胞内的蛋白表达。为此，我们需要先进行固定，使蛋白保持在原位，然后对细胞进行破膜以使得抗体能够进入。不过这么做会杀死细胞，如果只是分析是无所谓，但如果要对细胞进行后续操作（如进一步纯化和再培养），就不行了。



当心！
以下一些事项需要注意和控制：
1. 活化细胞会使细胞表面或内部某些蛋白表达水平增高或降低（如CD25表达在调节T细胞，但也会表达在活化的CD4+ T细胞）。
2. 有些抗体会杀死细胞（如Siglec F特异性结合嗜酸粒细胞，但也会在结合后诱导凋亡）。
3. 冻存-复苏或某些梯度离心，有时候会影响蛋白表达（如CD62L在经过Ficoll-Hypaque密度梯度离心后表达会明显增高）。
4. 用酶解方法解离细胞可导致一些蛋白表达的丢失。
5. 抗体有时候不一定只结合目的细胞，也可能会与错误的细胞结合，或结合到死细胞上。


免疫表型为生命科学研究提供了巨大的推动力，使得我们能够清楚地明确细胞性质，尤其是要区分混合细胞中各类细胞亚群时。例如，在某些癌症中，我们可通过免疫表型，了解细胞类型、癌症所处阶段、侵袭性如何等信息，对癌症严重性和预后进行判断。此外，我们还可以增加其它指标（例如胞内细胞因子），进一步了解细胞亚群功能。

wfz

流式细胞术，很复杂，也很重要，学习应从基础开始

Helen

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