小鼠Treg，加入foxp3后，所有群体都往foxp3阳性方向移动

zark_00

今天做小鼠的Treg，加入foxp3后，发现所有群体都往foxp3阳性方向移动。CD4+群体中，有明显的CD4+FOXP3+群体，本来结果挺好的，但就是所有群体都上移（foxp3做纵轴）。我的同型对照和单染（FITC CD4)，在同电压下都挺好，双阴在双阴区，单阳在单阳区，而且没有在foxp3方向上的任何位移。

请问倪老师和各位战友，你们遇到过这种情况么，是我染色后没有洗干净么（96孔板，200ul 洗涤，用的ebioscience的Permeabilization 液洗的，泡沫很多，没敢很吹

niwanmao

破膜之后会发生比较明显的非特异染色。

zark_00

niwanmao 发表于 2015-1-15 13:29
破膜之后会发生比较明显的非特异染色。

谢谢倪老师。是否说明我没洗干净呢，次数少了。还有，请问小鼠脾细胞里有CD4-Foxp3+的群体呢，我今天的结果里，有很多，几乎占CD4-群体的一半

niwanmao

zark_00 发表于 2015-1-15 17:21
谢谢倪老师。是否说明我没洗干净呢，次数少了。还有，请问小鼠脾细胞里有CD4-Foxp3+的群体呢，我今天的结 ...

有可能，这说明非特异性染色太强了。

zark_00

还有，我之前染ICR的CD3CD4CD8，阴阳性群体都分得很开，很明显。而近一段时间，染荷瘤鼠和其同品系正常鼠时，按推荐用量，和推荐用量的4倍，CD3无完整的阳性群，CD4CD8各自阳性群和阴形群间隔较以前小多了，虽然能分开，请问倪老师，这可能有哪些问题

niwanmao

zark_00 发表于 2015-1-16 08:52
还有，我之前染ICR的CD3CD4CD8，阴阳性群体都分得很开，很明显。而近一段时间，染荷瘤鼠和其同品系正常鼠时 ...

可能还是需要进行抗体浓度滴定吧

zark_00

谢谢倪老师回复。

后来一同事，做出来比较标准正常的结果。我把我的步骤，以及与别人的不同发出来，您给看看，是否有影响结果的地方

我的步骤，取脾后，用40um筛网和注射器橡胶头在培养基中研磨，得到悬液，离心弃上清，用自配ACK裂解液（配制时，本来是要用KHCO3，NH4CL, EDTA2Na 配方的，但当时缺KHCO3，订货要时间，就用了NaHCO3替代，做表面marker标记时，没发现较大差异，就是FSC VS SSC 图上 难以得到明显的淋巴细胞群体，几乎都是一团)2ml ，加入后混匀，立即室温5分钟离心，弃上清用培养基重悬再40um过滤一次，离心重悬，弃上清用 cell staining buffer 重悬，计数，调整后，按10^6个/100ul/孔，加到96孔板中，加适量IgG封闭，后按计划，加入荧光抗体及其同型对照 到相应孔，4度避光30分钟，加cell staining buffer 重悬后，离心弃上清，然后加入ebioscience 的Fixation/Permeabilization(已经按说明稀释好），4度避光过夜孵育，后离心弃上清，Permeabilization buffer 洗两遍，加适量IgG封闭，后按计划，加入FOXP3 荧光抗体及其同型对照,室温孵育2小时，Permeabilization buffer 洗两遍，cell staining buffer 重悬上机。
表面抗体孵育结束后，我们都是按照ebioscience 的One-step protocol: intracellular (nuclear) proteins 中相应步骤来的，而且从表面到胞内，抗体用量都一样。所以我推断可能在样本制备前半段有问题。

别人跟我不一样的地方有，


脾细胞是用的研磨棒在1.5mlEP管中研磨，很快，取了悬液，就往下一步。我的研磨相对较慢，而且我的样本多，总时间长。

再有就是别人用的lysis buffer 是 后来配的KHCO3，NH4CL, EDTA2Na 配方的。我担心二者PH有差距，我测了下，我的将近7.8，他的将近7.7，都不是标准的7.2-7.4。我不知道7.8对于细胞影响多大，对胞内核内的指标影响多大。
最后一点，我用的cell staining buffer 是 PBS+0.2%BSA+0.1%NaN3,pH是7.4. 别人就用PBS+1%FBS。我知道NaN3应该没影响，因为抗体中和 Fixation/Permeabilization，Permeabilization buffer 都有NaN3，而且我接触的商品化的cell staining buffer 里都有。 但这是跟别人不一样的一点，只能列出来。

写了这么多，请倪老师帮看看，做这个胞内核内很头疼，样本量又大，已经搞砸一两次了，快抓狂了。

niwanmao

zark_00 发表于 2015-1-17 10:55
谢谢倪老师回复。

后来一同事，做出来比较标准正常的结果。我把我的步骤，以及与别人的不同发出来，您给看 ...

你的意思是你有大批标本，第一个磨完之后，先取出来放一边，悬或着不悬，先晾着，然后继续第二个、第三个。。。直到最后一个磨完，再一起去染色？如果这样的话确实就影响细胞活性了。

此外，你磨完之后先裂解再染色这也会影响。

建议：
1、一个标本磨完之后先用staining buffer悬浮，放到4度，然后再继续下一个，最后可以一起抗体染色（暂时不要裂解，全部染完之后，如果还有红细胞，可以适当加点裂解液裂解）。
2、裂解液不能偷工减料，还是老老实实按照配方来，如果fixation/permeabilization处理完之后没有肉眼可见的红色，不裂解也可以。
3、有可能最好加live/dead鉴别试剂，会给你的结果带来意想不到的好处。

zark_00

终于搞清楚了，用的封闭IgG有问题，别人分装的，太久了，不知道确切是什么，换了个比较确定的IgG，结果如下
还有个 比较基础的问题，请教下倪老师，流式胞内外标记前的FcR封闭,不是该用抗体来源种属的血清或IgG么，即，抗体是大鼠抗小鼠的，则就用大鼠血清或IgG。怎么又有小鼠的样本，用小鼠的IgG封闭这一说呢，是不是错的啊，谢谢

niwanmao

zark_00 发表于 2015-1-25 09:49
终于搞清楚了，用的封闭IgG有问题，别人分装的，太久了，不知道确切是什么，换了个比较确定的IgG，结果如下 ...

当然需要同种的血清喽。给你一段话做参考：）

One important way to minimize non-specific staining is by the use of a so-called blocking reagent. A blocking reagent contains a high concentration of immunoglobulin that will bind to the Fc-receptors on cells like monocytes, thereby blocking the non-specific binding of the staining antibody reagents to these receptors. The blocking reagent should be immunoglobulin from the species whose cells you are staining. For human cells, use the g-globulin fraction from human serum at a final concentration of 4 mg/ml. Alternatively, one can purchase specific antibodies directed against the Fc receptors of the cells in question; care needs to be taken here as there are different classes of Fc receptors and, in addition, not all antibodies against Fc receptors block the receptor binding site.