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阅读流式细胞仪方法时，经常会看到一些描述，例如“将1×10E6细胞加入管中”。问题是如何确定管中的细胞数呢？在介绍方法之前，我们先来看点信息，了解一下细胞数量对实验结果的重要性。
为什么知道管中有多少细胞非常重要？
1、确保你有足够的细胞做实验
花了一整天的时间制备细胞、染色、分选，结果精密计划的一个实验，最后发现细胞量却不够，没有什么事情比这更打击人了。
这里有个公式对于明确你的细胞标本量是否足够很有帮助：
最后上机前所需的细胞数量×（1÷分选效率）×（1÷这类细胞占总数的百分比）＝实验开始所需收集的细胞量
表1列出了常见的不同表达比例的细胞量计算示例。
表1. 实验所需细胞数量计算示例
表1
2、细胞数量可影响染色
尽管精确的细胞数量可能对某些实验影响不大（例如表面染色），但对于荧光探针染色（如DNA、氧化还原、增殖等），则细胞数量对于实验的成功性影响很大。
3、对检测效应的结果影响很大
假如你要用流式检测一个药物对细胞的影响，那么细胞数量对这种效应的检测很重要。如果不知道细胞的精确数量，那么效应的计算也就无意义了。
4、染色过程中会丢失细胞
通过知道实验开始时的细胞数量和最后上机前的细胞数量，就能知道实验中的细胞丢失情况，从而可对实验步骤进行优化而减少细胞损失。胞内染色时，细胞丢失率可达初始细胞的70％，所以开始处理前至少需要100万个细胞，最好有300到400万个细胞。
细胞计数有哪些方法？
血细胞计数板
最好的办法是使用血细胞计数板。这种计数板由Louis-Charles Malassez发明，是一种特殊蚀刻过的载玻片，能容纳明确定义的体积的样本。如何正确使用计数板流式中文网已有介绍（《流式细胞术现代方法学》附录3A 细胞计数 http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1592-1-1.html、[视频] 科研基础课堂（15）使用细胞计数板来计数细胞 http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3371-1-1.html）。
血细胞计数板只需要玻片和显微镜即可，任何人都可以完成，可计数各种细胞类型，目前仍为细胞计数的金标准。
可惜的是，血细胞计数板还是有其局限性，首先要确保计数细胞的标准一致，否则就计数不准确，其次，需要大量的训练才能使计数保持一致（你可以让实验室同事计数同一块板，就会发现惊奇的结果！），再次，血细胞计数板依赖台盼蓝区分死细胞，最后，由于人工计数，所以数多个标本时非常费劲。
因此，可以选择一些自动计数系统，主要有三类：基于图像的技术、阻抗计数技术（Coulter原理）和基于流式的技术。
基于图像的技术
这类技术原理就是使用显微镜捕捉某个视野中的图像，然后利用仪器特异性软件，根据大小区分出细胞并计数。这种技术也是通过台盼蓝排除死细胞。
这类系统如果经过优化，可以快速计数并且结果稳定。但有个问题就是它们需要一种特殊的玻片或盒子，所以耗材费用较高，而且他们只能识别少数几种大小的细胞。
相关厂家有：Nexcelom、 Bio-Rad和Invitrogen。
阻抗计数技术
Coulter原理1953年发明，是现代全血细胞计数的基础，也是第一款细胞分选仪的基础。
其原理就是细胞通过充满电解液的两个流动室之间的小孔时，会发生电阻的变化，这种电阻变化与细胞大小相关。这种技术的缺点就是受细胞浓度限制，如果细胞太多，小孔就容易被阻塞。另一个问题就是需要确保电解液的正常。
Beckman-Coulter、Roche和EMD Millipore都有这类技术。
基于流式细胞术的技术
流式细胞术计数细胞分为两类方法：
1、泵/注射器
泵/注射器系统（如Accuri、Guava或MacsQuant，国内还有ACEA Novocyte）通过检测特定体积内的细胞数，从而可以精确计数。在这种系统中，还可以使用活性染料或表面染色确保排除死细胞或计数特定亚群。
2、微球参照方法
有些流式细胞仪（如LSR-II或Gallios）无法精确确定吸入样本量的体积，所以只能利用细胞与已知微球量的比例进行细胞计数。
这些计数微球的生产厂家包括BD Bioscience、Life Technologies和Spherotech等。
这种方法中，微球可以与细胞明显分开，根据检测到的微球量、细胞量，再结合已知的微球总数，可计算出细胞总量。该方法的缺点就是需要微球耗材。
细胞计数对流式细胞术结果的保障非常重要，现在有以上几类计数方法，每种方法都有优缺点。你更喜欢哪种方法呢？
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发表于 2015-1-22 20:23:34
发表于 2015-1-22 23:31:46
