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流式细胞术疑难解答(一):信号弱

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发表于 2015-1-27 16:45:02 | 显示全部楼层 |阅读模式

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如果抗体染色信号弱或无信号,可能是由于以下原因引起的:
LowSignal-img.png


1、抗体储存 DoNotFreeze-img.png
确保你的抗体保存在4℃并且避光。如果抗体结合了荧光素,那么千万不要冷冻保存,因为这可能会导致荧光抗体的沉淀和聚集。还有,要确保抗体没有过期。

2、稀释
你是不是一直在用厂家推荐的量做实验?你可能需要进行抗体滴定找到最佳抗体用量。
详见:
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html

3、仪器--滤光片设置
filterIMG.png

确保流式机器配置有合适的、能够检测到你所用荧光的激光和滤光片。例如Brilliant Violet™ 570需要紫光激光器和585/42的滤光片,如果你用了525/50滤光片,那么就检测不到信号了。
不同荧光有不同的发射谱,为了检测到信号,需要配置有能够捕捉到该波长信号的滤光片。在上面的例子中,525/50滤光片只能捕捉500~550nm的信号,而BV570的峰值波长在570nm,超出了范围,故无法被该滤光片检测到。
还有需要了解每根激光有多少个光电倍增管(PMT),如果紫光激光器只有3个PMT,那么你想检测4色就不可能了。

4、仪器--激光性能
laserAlignmentIMG.png

如果流式细胞仪的激光没有很好的校准,那么就可能导致某些通道(或所有通道)信号弱。使用一些校准微球可以很方便地检查仪器性能。所以记得按照流式细胞仪厂家的指导定期进行质量控制和优化检查。


5、抗原表达--表达密度
DensityIMG.png

某些抗原本身就表达非常弱,或者只有非常少的细胞群体表达,此时,表达弱就是正常的。可以尝试选择强的荧光素或选择SI值高的抗体(参见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html

6、抗原表达--细胞特异性
cellSpecIMG.png

有些单倍型特异性标记只表达在某些系别的小鼠上,所以购买抗体前需要详细阅读抗体说明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。
而且,流式细胞术基于逐级设门,如果门一开始设错了,也可能影响最后的分析结果,导致假性弱表达。

7、抗原表达--表达位置
locationIMG.png

要知道,有些抗原表达在细胞表面、有些表达在胞浆、细胞器内、胞核,甚至有些所有部位都表达。所以需要采用合适的方法学去检测。

8、抗原表达--诱导

诱导

诱导


有些抗原在活化后发生下调,而有些标记和细胞因子则需要诱导才能表达(参见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html),如果你不经过诱导就检测这些标记或细胞因子,就会出问题。

9、缓冲液
你实验使用的缓冲液是否正确?例如Biolegend的FoxP3在他们自家的foxP3缓冲液中性能良好,但如果换了其它家的缓冲液,可能就检测不出来了。同样,其它厂家大多也是如此。固定和破膜缓冲液也十分重要。

10、二抗
secondaryIMG.png

如果你一抗用了纯化或生物素标记的抗体,那么二抗是否用了正确的抗体?例如一抗用了Rat Anti-mouse,那么你的二抗应该用Goat Anti-Rat,同时应该用只加二抗的管子作为空白对照检测背景荧光。
还有,你应该检测一下二抗是否还会跟其它一抗发生反应,这有助于发现是一抗还是二抗的问题。


11、固定
你是否在染色前固定或破膜了?固定和破膜能够改变抗原表位和抗体的相互作用,这种敏感性是抗原依赖性和克隆依赖性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)这几个表位通常在去污剂或甲醇处理后是不稳定的。而有些抗原位点则需要固定后才能与抗体结合而被检测到,例如核内抗原PCNA和Ki67。
此外,固定时间不能太长,否则容易导致交联反应而影响荧光素的化学特性或增加自发荧光。


12、贴壁细胞和受体

贴壁细胞

贴壁细胞


如果你在检测贴壁细胞,使用的是胰酶消化,那么需要注意胰酶可能会影响一些表面标记的表达。类似的现象也会发生在胶原酶消化后。

13、噪音和背景信号
PMT的背景信号和噪音高也会导致信号弱,这可能是由于激光源的散射光、其它荧光素的渗漏或自发荧光过强等原因引起。

14、荧光渗漏

补偿

补偿


荧光渗漏是多色流式时检测信号出问题最常见的问题所在。所以,正确的补偿非常重要。
关于补偿,请参见帖子:
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html


发表于 2015-3-26 19:22:36 | 显示全部楼层
图文并茂,流式细胞非常有发展前景
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