流式细胞仪 激光laser 通道 filter Fluorescence 概念

liliqianyi

各位好，接触流式一段时间了，但是发现对于原理还是不太明白，特别是激光系统的几个不同的概念，激光器、通道、滤镜、荧光。
目前的理解，流式不同的仪器有不同的LASER,然后一个laser 又会有各自好几个通道，各个通道又有相应的滤镜，比如710/50，然后敷有荧光抗体的细胞，又发出不同的光。
但还是概念不清，很混乱，各位大神能帮忙解释一下这几个不同的概念吗，从流式整个的光学系统来看。
最好是举例说明，结合图片，多谢了，附件表BD  LSR Fortessa 的配置。

ddn111

Fortessa激光也多，通道也多没找到合适的图，就看看CALIBUR的示意图，双激光四通道，道理类似！

1、单激光或多激光激发细胞表面标记的荧光素后产生的是复合光，要通过滤片系统把复合光进行分解，送到不同的检测器，就是常说的通道（FL1-FL4等）了！
2、不同机器的检测器依据配置不同而不同；

liliqianyi

比如，就不明白，这个激光488nm，和后面滤镜 荧光波长的关系。
为什么有的FITC和PE 都是蓝激光，这个又不是。

niwanmao

每种激光波长可以激发多种荧光素，这些荧光素会发出不同的波长，所以需要用不同的滤镜来检测。

例如488nm激发很多荧光，其中的FITC荧光，首先通过505LP反射镜反射（就是反射>505nm的光）到530/30的滤光片（过滤500~560nm的光），就能够正确检测到FITC的荧光。

其它荧光同样道理。

liliqianyi

niwanmao 发表于 2015-7-6 22:02
每种激光波长可以激发多种荧光素，这些荧光素会发出不同的波长，所以需要用不同的滤镜来检测。

例如488nm ...

倪老师  很弱的问一句  这几个概念和我们平时说的 荧光抗体搭配时，需要在不同的荧光通道，这个说的通道是指哪个。 或者说FL1 FL2 FL3是怎么划定的，我们在搭配抗体时看哪一项以确定在不同的荧光通道。
而补偿大小是否是看发射光波长的峰值位置。
多谢倪老师了。

niwanmao

liliqianyi 发表于 2015-7-7 20:45
倪老师  很弱的问一句  这几个概念和我们平时说的 荧光抗体搭配时，需要在不同的荧光通道，这个说的通道是 ...

平时的荧光通道对应的是Filter（滤光片），至于FL1、FL2之类是，视机器不同而不同，你只要知道哪个荧光在哪个通道检测就OK了。

liliqianyi

niwanmao 发表于 2015-7-7 20:58
平时的荧光通道对应的是Filter（滤光片），至于FL1、FL2之类是，视机器不同而不同，你只要知道哪个荧光在 ...

可是大部分的荧光  filter都不一样啊  
那么组合的时候 就主要考虑补偿不能太近吗
图上的荧光燃料 filter都不太一样

chymanhz

你拿到抗体时，你会看到说明书里提到激发光多少波长范围，发射光多少范围。这里提到的激发光波长就是激光器的波长，激光器波长必须是这个范围内的，比如FITC他可以被450~500内的光激发（小于450和大于500的也可以激发，就是效率太低）。如果用476nm的激光激发，激发效率只有56%，用488nm就可以到88%。88%怎么理解，你可以理解为FITC染色的抗体每100个荧光分子有88个被激光打中，发出发射光。那他的发射光是什么范围，从500一直到650nm都有，也就是通常意义上的PE，PerCP通道都会有FITC分子发出的光。但是FITC发射光谱的主峰在519nm范围内，如果你的滤光片是530/30，也就是从515到545nm，那么FITC的主峰就在你这个滤光片里了，采用530/30滤光片，你就可以采集到大概全部荧光量的47%，如果你采用的是525/40，那么你就可以采集到63%的荧光量。

所以，选择染料，你需要考虑他是用什么激光激发的，激发后的发射光在什么范围内，基本上就可以知道自己要哪个通道了。至于你附件中的mirror，主要用于分光。比如刚才提到的FITC从500到650都有光，那么比如这个505nm的mirror，他就会把505nm以下的光反射或者投射到488/10的通道，505以上的就投射或者反射到后面的波长通道，然后685lp再分一下，分为685nm以上的送到710/50通道，675nm以下，505nm以上的就留在530/30通道了，那530/30这块filter的作用就是你给我505~685nm的光，我只要其中的515~545nm，其他我就反射掉。最后到了PMT上就只能是这个波长的光。

Arcrain

这是非常基础的问题，慢慢就会明白的。
正好有时间，这里解释一下：


1.荧光染料：
     是能够吸收特定波长的光子（激发光），并将所吸收的光子能量以更长波长的光子发射出去的分子（发射光），流式检测的就是这个荧光信号。荧光染料有激发光谱（即所有能激发这个染料的光子波长，波长不同激发程度不同）和发射光谱（被激发的荧光染料发射出来的所以光子的波长范围分布），不同种类的荧光分子这两个谱线分布不同（发射光谱一般都相当宽，往往跨越150nm以上的范围），不同荧光分子可能会存在相同的波长谱线（光谱重叠）。不多解释了。所以流式细胞仪要配多种波长的激发光，并且要收集不同波长范围的光信号。


2.激光：
      流式细胞仪上用来激发荧光染料的光源。激光单色性非常好，如488nm激光，它的波长基本就是488nm，没有其它波长的光子。


3.不同流式上的激光：
       A.一般而言，所有流式都有488nm这个激光，这是历史造就的。
       B.不同仪器上有其它波长的激光，用来激发更多种类的染料，常用的包括561nm，638nm，405nm，355nm。具体装有哪些激光，看各厂家的仪器型号和配置（要价），买仪器时一般你都可以选择配置那些波长的激光。

4.多种波长的激光光束分别照射在流动的细胞队列的不同位置。

如图（Laser.jpg），可以看到有四种颜色的直线穿过一个明亮的圆形区域，中间出现亮点。
这四条直线就是激光束，它们是分开的。亮圆斑是现在常采用的针孔镜（Pinhole），它很小，而且只对准一根激光的激发点。激光从左到右传播，液流从上往下流动（或者反过来），激光垂直照射在液流上，它们都是在亮圆斑前面经过。图上亮圆斑和激光中心的高亮光点就是液流中被激光照射而发光的细胞。它发出来的荧光信号就被后面那个亮圆斑代表的针孔镜收集，进入其它激光对应的针孔镜的几率非常低，因此针孔镜极大降低了激光间的荧光干扰。

5.每一束激光必须对应一个针孔镜和一套分光探测光路。
分光光路如图（ex-flow）所示。这里显示的只是传统的透射分光方式。
Dichroic：二色分光镜，根据光学涂层的不同，让特定波长的光通过，其它波长的光被反射。如600LP即600nm长通镜（Long Pass），能让600nm以上波长的光直接通过，而600nm以下的光被反射到另一个方向，从而将光分开。短通则相反，600SP（Short pass）让600nm以下的光通过，而600nm以上的光被反射。
BandPass Filter：带通滤光片，只让一定波长范围的光通过，其它被反射。如530/30BP，表示已530nm为中心，正负15纳米范围的光都可以通过（即515nm--545nm的光都可以通过）。分光镜和滤光片组合构成的分光光路往往都是根据常用的荧光素光谱精心设计好的，让可被对应激光激发的多种荧光染料发出的特定波长的荧光成分都被单独分离出来，分别进入感光探测器（通常是光电倍增管PMT，而不是CCD）。当然，因为光谱重叠，让探测器探测到的荧光包含其它荧光染料发出来的部分光子，这就需要通过荧光补偿进行修正。

6.通道。由以上可知，每个探测器探测的是一定波长范围内的光子，这就构成通常说的“荧光通道”。并通常用带通滤光片的规格或者它所对应的常用荧光染料名字或仪器对探测通道的排列命名来称呼，如530/30通道、绿光通道、FITC通道、FL1通道等等。一种波长的激光可以激发多种不同发射谱的荧光染料，让他们可以同时在不同荧光通道上被检测到。具有相似的发射谱但激发谱不同的两个荧光染料也可以同使用而不相互干扰。


好了，终于咬牙写下来了，不打字了，连我自己都被啰嗦得受不了了！！！其它的东西楼主自己体会吧，很简单的！

来瓶4/8血

做多就会明白了