Th17细胞刺激/阻断培养后出现絮状物

goddoor

测人血Th17细胞，最近测得的结果变化很大，而且在刺激及阻断时，培养细胞后可见絮状物，麻烦大家帮忙看下操作及试剂哪里需要改进。
步骤及所用试剂如下：
1、取2ml EDTA抗凝血，无菌下提PBMC；
2、细胞计数约2-3X10 6个；取一半用于检测Treg，另一半重悬于无血清1640培养基，加2ul刺激/阻断混合剂（BD公司，成份PMA、Ionomycin,Brefeldin A)，充分混匀，37℃ CO2培养箱 5小时。5小时后收细胞，镜下见细胞数增多，形态没有太大变化，有时细胞表面可见一层薄膜，培养基内可见白色絮状物，镜下见絮状物内无细胞存在。
3、离心1500rpm,5min收集细胞；
4、染CD4（ebioscience,FITC）;
5、同时固定/破膜（ebioscience 测人Treg试剂盒套装里的），100ul,4℃，30min；
6、染IL-17A（ebioscience,APC）
结果如下：出现絮状物时CD4细胞分群都看不清楚，如果培养时没有絮状物CD4分群还可以，但IL-17A分群不好。
问题主要有几个：
1、上述操作和所用试剂有没有什么问题，需要哪些改进？
2、培养时出现絮状物的原因，如果避免？

niwanmao

应该还是培养条件的问题，絮状物就是细胞死亡后的“尸体”。
染色问题不大。

goddoor

niwanmao 发表于 2015-7-14 19:23
应该还是培养条件的问题，絮状物就是细胞死亡后的“尸体”。
染色问题不大。 ...

谢谢倪老师，我最近又测了几次，发现CD4分群还比较明显，但IL-17A同型对照管比IL-17A管的阳性率还高，同型对照和抗体都是在EB公司买的，而且免疫球蛋白的类别及亚型都是一样的。分别用不同的临床样本测了三次，每次都是这样，最后一次在表染前先加了大鼠血清先封闭Fc段，但结果还是这样的，这种情况怎么解决？
附图：在CD4阳性细胞群里圈细胞。

niwanmao

goddoor 发表于 2015-7-20 10:47
谢谢倪老师，我最近又测了几次，发现CD4分群还比较明显，但IL-17A同型对照管比IL-17A管的阳性率还高，同 ...

同型对照为什么细胞这么少？获取同型对照标本之前是不是获取过阳性标本？

goddoor

niwanmao 发表于 2015-7-20 11:17
同型对照为什么细胞这么少？获取同型对照标本之前是不是获取过阳性标本？ ...

就是把2ml血先提PBMC，差不多1/3做Treg,2/3做Th17，刺激后先一起表染，固定破膜后再分成2份，一份正常染IL-17A抗体，一份染同型。可能是分的时候没分均匀，我看了下虽然同型细胞数少，但CD4+细胞占淋巴细胞的比例差不多

niwanmao

goddoor 发表于 2015-7-20 21:10
就是把2ml血先提PBMC，差不多1/3做Treg,2/3做Th17，刺激后先一起表染，固定破膜后再分成2份，一份正常染I ...

数量相差这么大，说明处理中本身就存在问题，并且同型对照也出现如此明显的阳性群，提示可能管路有被阳性标本污染的可能。

goddoor

niwanmao 发表于 2015-7-20 21:25
数量相差这么大，说明处理中本身就存在问题，并且同型对照也出现如此明显的阳性群，提示可能管路有被阳性 ...

管路被污染的可能性比较小，因为我是固定破膜后重新再拿一个管子做同型，而且每次测流式时都是先上同型。以前做的两组细胞数都差不多（见下图），就这次两组细胞悬殊很大。实验室的老师建议我做一份不给予刺激的细胞，同样染CD4及IL-17A，再根据这个跟刺激后的细胞比较来圈门，倪老师有什么建议。

niwanmao

goddoor 发表于 2015-7-20 21:45
管路被污染的可能性比较小，因为我是固定破膜后重新再拿一个管子做同型，而且每次测流式时都是先上同型。 ...

可以试试。同型对照一般不到非不得已不用，因为选择不到完全匹配的，尽量选择阴性对照（例如标本中本身不表达该类抗原的，未刺激细胞等等）。

goddoor

niwanmao 发表于 2015-7-20 22:19
可以试试。同型对照一般不到非不得已不用，因为选择不到完全匹配的，尽量选择阴性对照（例如标本中本身不 ...

好的，谢谢倪老师

freshrain

做胞内刺激的样本，应该使用肝素抗凝的采血管，EDTA会和刺激剂有一定的作用。