CFSE检测PBMC中T细胞增殖情况

EthanMr

最近在做CFSE检测PBMC中T细胞增殖情况，实验结果不确定如何圈门分析，向各位老师请教一下，非常感谢！
一、实验步骤
1. 分离PBMC
2. 使用cayman chemical公司的CFSE，按照说明书1:1000稀释，每10^6细胞，加入1 mLCFSE稀释液，室温10分钟后，用10%FBS 1640培养基终止，离心去上清，用培养基洗2次后，再加入新鲜培养基，接种细胞到12孔板中培养，每孔500 uL培养基，3X10^6细胞。实验组和对照组均加入IL-2 50U/mL，CD28 1 ug/mL（abcam），CD3 （abcam，浓度不确定，约10-50ug/mL，加入16.5 uL）。
3. 培养2天后，发现培养基变黄，换液一次，重新加入IL-2、CD28、CD3。
4. 继续培养5天，染色CD3-APC、CD4-PE、CD8-PerCP，BD Callibur检测，每样本收20万细胞。
二、分析结果如下1.样本A的CD4 T细胞分析
问题：1）对照组和实验组CD4 T细胞的圈门大小不一样，这样圈门是否合适？
          2）实验组画红圈的那一群细胞是怎么回事，是否应该算在CD4 T细胞群中？
          3）CFSE为什么只有一个峰？是因为没有增殖吗？如果没有增殖，是我实验过程中出了什么问题吗（比如IL-2、CD3、CD28加入量不够）？
PS：之前做过凋亡检测，发现实验组处理24小时后会有大量细胞凋亡。


2.样本A的CD8 T细胞分析
问题：实验组是已经没有CD8T细胞了吗？


3.样本B的CD4 T细胞分析




4.样本B的CD8 T细胞分析
问题：CD8 T细胞的圈门是否正确？



原始数据：
A样本 A 样本.rar (3.37 MB, 下载次数: 21)

2015-9-13 23:34 上传

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B样本 B 样本.rar (3.26 MB, 下载次数: 12)

2015-9-13 23:34 上传

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niwanmao

1、圈门大小不一样没关系，关键是圈到正确的细胞。
2、红圈那群是死细胞，非特异性染色。
3、只有一个峰，会不会是CFSE浓度、时间的问题。
总之，你的实验组细胞死的太多了，不太合适做增殖。

guyue54guyue

帮忙顶一下  同样想了解

EthanMr

niwanmao 发表于 2015-9-14 13:42
1、圈门大小不一样没关系，关键是圈到正确的细胞。
2、红圈那群是死细胞，非特异性染色。
3、只有一个峰， ...

非常感谢倪老师的解答。
我还想问一下：
1. 样本B的CD8T细胞分析中，对照组CD8 T细胞的圈门是否合适？还是说只圈最上面一群细胞？

niwanmao

EthanMr 发表于 2015-9-14 15:24
非常感谢倪老师的解答。
我还想问一下：
1. 样本B的CD8T细胞分析中，对照组CD8 T细胞的圈门是否合适？还是 ...

CD8的圈门不对，应该圈表达高的那群，下面弱表达的这群更像是死细胞非特异性染色。

EthanMr

niwanmao 发表于 2015-9-14 18:30
CD8的圈门不对，应该圈表达高的那群，下面弱表达的这群更像是死细胞非特异性染色。 ...

明白了，非常感谢倪老师的耐心解答。

linhai52086

您好 请问单峰问题解决了吗 我做的也是单峰 想交流一下 谢谢

niwanmao

linhai52086 发表于 2017-6-15 16:00
您好 请问单峰问题解决了吗 我做的也是单峰 想交流一下 谢谢

关键问题有以下几个：
1、需要用死活染料，去掉死细胞。
2、最好用CD3，圈出纯粹的T细胞。
3、CFSE的浓度需要注意。
这三点做好了，结果就会好看。