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[标本处理] 关于CD3间接抗体的检测

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发表于 2017-1-11 14:53:34 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
现在手头有3个CD3抗体,想测试一下是否可以用于流式检测,用的细胞是Jurkat,二抗是Flour 488荧光二抗,有几个问题想确定一下:
1.细胞量:每管是10的6次方个细胞/100ul细胞悬液
2.一抗量:一般多少细胞对应多少抗体量呢,比如0.5ug-5ug?
3.洗液:a. 看到有些资料中写的是PBS,有些是1%FBS的PBS,还有别的几种,请问下有什么区别呢?
              b. 整个实验都用PBS可以吗,包括一抗二抗的稀释液?
4.固定液:固定液是1%多聚甲醛。
              a. 这个实验需要对细胞进行固定吗?如果需要,是在哪一步进行固定呢?
              b.另外,如果是二抗之后再固定,是否可以用1%多聚甲醛将细胞重悬后直接上机测,还是固定一定时间后用PBS洗一下,再用PBS重悬后上机测?
5.洗涤:一抗孵育完成后,细胞要振荡后再加PBS,离心洗涤还是不加PBS直接离心?

发表于 2017-1-11 15:20:09 | 显示全部楼层
为什么不直接用人的外周血?外周血的T细胞CD3非常强。
Jurkat的CD3不一定强,尤其是那些传代很久的,可能性质都变了。
 楼主| 发表于 2017-1-11 22:34:26 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-1-11 15:20
为什么不直接用人的外周血?外周血的T细胞CD3非常强。
Jurkat的CD3不一定强,尤其是那些传代很久的,可能性 ...

因为实验室里有Jurkat细胞,但是人外周血不好取,所以选用了Jurkat
发表于 2017-1-12 09:52:41 | 显示全部楼层
我也在做相同的实验,也是用的CD3抗体,样本也是Jurkat细胞。你的实验中有没有出现细胞不固定的话很容易聚团下沉,孵育过程中老是要振荡
发表于 2017-1-12 09:53:41 | 显示全部楼层
再请问下你那边1%多聚甲醛的配方,我老在用现成的4%的,不知道效果是不是太强了
发表于 2017-1-12 09:56:42 | 显示全部楼层
另外我做多次实验,发现间接法的非特异信号特别明显,二抗孵育前用山羊血清孵育下可以有效降低这些信号

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 楼主| 发表于 2017-1-12 16:35:53 | 显示全部楼层
Justin-威 发表于 2017-1-12 09:53
再请问下你那边1%多聚甲醛的配方,我老在用现成的4%的,不知道效果是不是太强了 ...

我以前做的是用CD3未纯化的腹水,用C6做的,结果还可以。这次用的是纯化的抗体,今天检测了一下,用的calibur仪器,竟然没有收集到细胞。不知道是不是cellquest软件设置的原因。
多聚甲醛是用8%的稀释的。
 楼主| 发表于 2017-1-12 16:36:51 | 显示全部楼层
Justin-威 发表于 2017-1-12 09:56
另外我做多次实验,发现间接法的非特异信号特别明显,二抗孵育前用山羊血清孵育下可以有效降低这些信号 ...

请问你的二抗用的多少比例的,哪种二抗呢?你的具体实验步骤可否参考一下
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