CD25及IL-10/IL-17染色CD25染不出来

长风万里无云

各位老师好：
          我的panel包括CD127,CD25以及胞内的IL-17及IL-10.以前完全是表面染色的panel，CD25可以很好的染出来，但是现在做胞内染色之后，CD25就怎么都染不上，试过了预染（先加CD25孵育20分钟，再加pma离子霉素高尔基等刺激），CD25还是会掉。还换了破膜剂，目前试过了BD的TM破膜剂，破胞膜的普通破膜剂，以及染CAS-3的破膜剂，还有EBIO的foxp3破膜剂，普通破胞膜的破膜剂，CD25都会掉，现在完全找不到原因，请各位老师帮帮忙指导一下。

niwanmao

确实如此，破膜剂基本上对表面标记多少会有影响，尤其是CD25本来就与活化有关，更容易受影响。
但是像分群这样完全分不开的，我觉得需要考虑滴定一下抗体用量，然后再注意一下固定和破膜时间。

长风万里无云

补充一下，这是拿人的PBMC做的，先圈CD3CD4双阳，再圈CD127和CD25，另外CD127-BV421;CD25-APC;

长风万里无云

谢谢老师！那我就再试试增加抗体用量之后有没有改善，另外我用ebio-foxp3破膜剂一般固定破膜半小时，是时间有点长了吗老师？因为很多人都做过CD25和foxp3一起染，CD25都能染出来，但是我的实验一直解决不了这个问题很头疼。

长风万里无云

我之前抗体一直是用了1.3ul，拜读了您的帖子，是不是应该再试试2.5ul和5ul？还是应该试试低于1.3ul的用量呢？之前未破膜的panel一直是用1.3ul效果比较好。

niwanmao

长风万里无云 发表于 2017-5-23 08:59
谢谢老师！那我就再试试增加抗体用量之后有没有改善，另外我用ebio-foxp3破膜剂一般固定破膜半小时，是时间 ...

滴定抗体，不一定就是增加抗体用量。

CD25实在染不出来，只能换抗体，因为CD25不同厂家之间质量差异是挺大的。

长风万里无云

谢谢老师，我明天再做做看，主要是这只CD25表染一直没问题，就是破膜才有问题，所以一直没往抗体本身有问题上面想

ghqiu09

长风万里无云 发表于 2017-5-23 15:05
谢谢老师，我明天再做做看，主要是这只CD25表染一直没问题，就是破膜才有问题，所以一直没往抗体本身有问题 ...

倪老师也说了，注意下固定破膜的时间，不单单是抗体的问题。。。

长风万里无云

今天又做了实验，我缩短了破膜时间到20min，CD25-APC染出来了，但是比表染要少。并且对比了BD公司的CD25-PE发现比CD25-APC染的更好一些。因为panel已确定的原因只能用CD25-APC，也对比了以前别人做的发现BD的CD25-APC效果比BIO的CD25-APC要好。现在就在纠结要不要再新买抗体，因为之前买了BD的抗体出了问题。老师您帮我看看CD25-APC染成这样能用吗？
另外您对破膜剂有过对比吗？BD公司的TF破膜剂会不会比EBIO的foxp3的破膜剂对表面marker的影响小一些？

niwanmao

长风万里无云 发表于 2017-5-24 22:05
今天又做了实验，我缩短了破膜时间到20min，CD25-APC染出来了，但是比表染要少。并且对比了BD公司的CD25-PE ...

看着CD25 PE效果更好一些。