流式检测血小板活化，你还是要求临床扔掉第一管血吗？

niwanmao

血小板的无反应性或高反应性都会导致血小板功能性疾病，所以血小板功能测定非常有用。 由于血小板易于在体外被人工激活，因此严格关注分析前的因素，特别是采血方法。 血小板疾病诊断评估指南建议利用真空或注射器将血液吸入采集管，但是许多人认为真空系统易使血液受到更高的剪切应力，导致人为的血小板活化。此外，临床实验室标准协会（CLSI）建议用蝶形针（也就是我们国内常用的静脉留置针）进行真空采血时要丢弃第一管血，理由这类针头有一段空间的血在第一管抽血时不会进入管内，导致第一管血的抗凝剂/血液比例不正确。


这就是蝶形针

流式细胞术可通过评估表面受体如P-选择素、血小板-单核细胞复合物或纤维蛋白原结合等指标快速测量体外血小板活化。抽血的因素是否真的会影响功能检测结果呢？

Emma L. Welch在Platelets 2018年10月29日在线发表的文章《Agreement between blood draw techniques for assessing platelet activation by flow cytometry》中，评估了4名男性和6名女性的血小板功能，对比了蝶形针真空连续采集两管（Vac-1、Vac-2）和手动连续抽取两管（Syr-1和Syr-2）的结果，抗凝剂均采用柠檬酸钠，采血量一致。
对比指标为P选择素和血小板-单核细胞复合物。

P选择素检测
20ul全血，与20ul含CD62P的PBS、0.1/1/10um三个浓度梯度的ADP混合（2ul）混合，室为孵育20分钟，其中个别样本另加CD42b以确认血小板位置。最后加400ul 1％多聚甲醛固定，上机分析CD62P表达。

血小板-单核细胞复合物检测
40ul全血，与40ul含CD14和CD42b抗体的PBS、0.1/1/10um三个浓度梯度的ADP（4ul）混合，室温孵育20分钟，然后加入800ul红细胞裂解液作用10分钟，离心重悬上机检测，分析CD14＋CD42b＋的血小板-单核细胞复合物比例。

结果如下：


很显然，不同的抽血方式对结果无影响。
指南主张在使用蝶形针真空采血时需要丢弃第一管血，而实际上这里证明了在第一管和第二管之间基础或刺激的血小板P-选择素表达、血小板-单细胞复合物比例均是一致的。因此，没有必要丢弃第一管血。
对比注射器或真空管采集的结果，也是一致的，所以没必要统一采集的方法。

虽然这篇文章样本量还太少，但至少说明，指南有时候也未必是正确的，实践最重要。

参考文献：https://doi.org/10.1080/09537104.2018.1535705

W3YC

倪老师 我在微信公众号也看了这个文章，但是您说的因抗凝剂和血液比例不一致导致，但是血液和抗凝剂比例不一致我个人觉得并不是要抛弃第一管血的原因。
我们知道血小板的功能是激活，聚集，黏附，释放，收缩
当血管壁发生破坏，血小板就会立刻激活，我们之所以抛弃第一管血是因为抽血的瞬间血管壁破坏，附近血小板立刻激活，这时第一管血里的血小板激活比例就高了
我是这样理解，望老师指导
另外，我们临床采集病人标本很困难，我就是采用采血针里的200ul血液在做试验，结果尚可，还需要进一步统计

niwanmao

W3YC 发表于 2018-11-13 21:49
倪老师 我在微信公众号也看了这个文章，但是您说的因抗凝剂和血液比例不一致导致，但是血液和抗凝剂比例不 ...

老外用的是那种蝶形针，所以在原理关注点会略有不同。至于你所说的这个理论，我也一直以为如此，但现在看来，可能并没有这么大的影响，可能只是人为的想象，但要否认既往的理解，确实需要继续多对比一些病例。
期待你更多的结果

overcome1996

倪老师，最近做血小板活化方面的流式，要用剪切力诱导血小板活化，不知道活化血小板的活化状态能维持多久，是否活化时间能够坚持到荧光染色➕固定。还有就是多聚甲醛是可以保持这种活化状态2-8天是吗？

niwanmao

overcome1996 发表于 2021-5-14 11:28
倪老师，最近做血小板活化方面的流式，要用剪切力诱导血小板活化，不知道活化血小板的活化状态能维持多久， ...

诱导活化可以用剪切力，也可以用ADP等。活化维持多久目前没看到准确的数据，但活化好进行固定即可。