查看: 955|回复: 15
收起左侧

[流式分选] 流式实验具体步骤请教

[复制链接]
发表于 2018-11-14 11:17:24 | 显示全部楼层 |阅读模式
10流星
本帖最后由 XY星雨XY 于 2018-11-14 14:37 编辑

大家好!请教下关于流式的问题,准备用流式测定血小板活化,即检测CD62P的表达。图片中是文献的方法和结果,不太明白:测定CD62P表达,只用anti-CD62P-PE一个抗体不可以吗?为何还要用anti-CD42b-FITC这个抗体呢?另外结果中材料组和阳性对照组差不多,感觉不太靠谱呢? 还有就是最后用的Mouse IgG-PE这个同型对照,具体实验过程中该如何添加呢?

下面是我的实验方案,不知道是否合理,第一次做不太懂,还望大神们指导一二!


1、从医院采集新鲜柠檬酸抗凝全血,100g离心5min

2、收集上清富含血小板血浆于离心管中,带回实验室中(路程需20min),在实验室用PBS按体积比1:1稀释   过程是否需要低温

3、血小板悬液90μL10μL不同浓度悬浮在PBS里的六种超顺磁氧化铁纳米材料孵育30min室温?37度?

4、孵育后,取10μL的混合液稀释于90μL HEPES缓冲液中。(3个平行,共取30μL,分别稀释,或者更多平行?

5、避光加入5μL anti-CD62P-PE5μL anti-CD42b-FITC是否需要低温,可否只加一种抗体

6、流式测定血小板激活的标志物CD62PP-选择素)的表达量。

注:阳性对照为牛凝血酶(1U/mL,溶解在PBS里?)、阴性对照为PBS,处理同样品组。

这里涉及双阳、双阴和单阴吗


文献里鼠IgG-PE作为非特异性结合对照,我该怎么设置呢?


求大神指导!多谢啦!

1542165625(1).png
1542165667(1).png
发表于 2018-11-15 11:10:52 | 显示全部楼层
2、过程是否需要低温?考虑温度对血小板活化的影响,影响大的话,运输和保存则尽量低温。
3、血小板悬液90μL与10μL不同浓度悬浮在PBS里的六种超顺磁氧化铁纳米材料孵育30min。室温?37度?同2,根据影响以及活化效果决定的。可查阅文献。同时需加入阴性对照,阳性对照,同时孵育。同8个样本。
4、孵育后,取10μL的混合液稀释于90μL HEPES缓冲液中。(做3个平行,共取30μL,分别稀释,或者更多平行?)2个平行即可,一个用于同型对照:anti-CD42b-FITC+IgG-PE,一个用于CD62p检测:anti-CD62P-PE+anti-CD42b-FITC。另外,阳性对照需要增加2个平行,用于FITC和PE单染,用于调节补偿。
5、避光加入5μL anti-CD62P-PE和5μL anti-CD42b-FITC(是否需要低温,可否只加一种抗体),4℃孵育30min,室温10-15min,二者均可。CD42b是血小板膜糖蛋白,流式检测时,可根据CD42b圈选血小板,排除碎片等干扰。建议进行染色。
6、流式测定血小板激活的标志物CD62P(P-选择素)的表达量。
     通过单染,调节补偿
     样本管,圈选CD42b血小板,通过同型,获得样本CD62P的比例。

评分

参与人数 1流星 +3 收起 理由
niwanmao + 3 感谢分享

查看全部评分

 楼主| 发表于 2018-11-15 17:07:20 | 显示全部楼层
sunny2829 发表于 2018-11-15 11:10
2、过程是否需要低温?考虑温度对血小板活化的影响,影响大的话,运输和保存则尽量低温。
3、血小板悬液90 ...

非常感谢您的指导!还有个问题,做同型对照时,加入IgG-PE的体积也是和其他抗体一样,同样加入5μL吗?
发表于 2018-11-16 08:45:25 | 显示全部楼层
XY星雨XY 发表于 2018-11-15 17:07
非常感谢您的指导!还有个问题,做同型对照时,加入IgG-PE的体积也是和其他抗体一样,同样加入5μL吗? ...

根据抗体用量加入的,都加1ug,或者0.5ug
 楼主| 发表于 2018-11-23 09:22:27 | 显示全部楼层
sunny2829 发表于 2018-11-16 08:45
根据抗体用量加入的,都加1ug,或者0.5ug

不好意思,还得再次麻烦您!这个上机前是要把血浆再次离心,沉淀血小板,然后PBS重悬,在PBS体系里上机测定吗
发表于 2018-11-23 10:58:20 | 显示全部楼层
XY星雨XY 发表于 2018-11-23 09:22
不好意思,还得再次麻烦您!这个上机前是要把血浆再次离心,沉淀血小板,然后PBS重悬,在PBS体系里上机测 ...

是的。抗体孵育后,一般都需要洗涤1-2次的。
 楼主| 发表于 2019-1-4 17:02:29 | 显示全部楼层
sunny2829 发表于 2018-11-23 10:58
是的。抗体孵育后,一般都需要洗涤1-2次的。

非常感谢您的回答,我做了一次,但结果不理想,不清楚什么原因,阳性对照组结果偏低,阴性组也挺高,能否帮我分析一下呢
发表于 2019-1-4 17:54:09 | 显示全部楼层
XY星雨XY 发表于 2019-1-4 17:02
非常感谢您的回答,我做了一次,但结果不理想,不清楚什么原因,阳性对照组结果偏低,阴性组也挺高,能否 ...

数据可以发上来,我们帮你分析分析
 楼主| 发表于 2019-1-5 23:02:25 | 显示全部楼层
sunny2829 发表于 2019-1-4 17:54
数据可以发上来,我们帮你分析分析

yang-1-4,单染anti-CD62P-PE

yang-1-4,单染anti-CD62P-PE

阳-1-6,检测anti-CD42b-FITC和anti-CD-62P-PE

阳-1-6,检测anti-CD42b-FITC和anti-CD-62P-PE

阴-1-1,阴性同型对照,anti-CD42b-FITC和lgG-PE

阴-1-1,阴性同型对照,anti-CD42b-FITC和lgG-PE

阴-1-2,阴性对照,空白,无染色

阴-1-2,阴性对照,空白,无染色

阴-1-5,阴性检测组,染色anti-CD42b-FITC和anti-CD-62P-PE

阴-1-5,阴性检测组,染色anti-CD42b-FITC和anti-CD-62P-PE

阳-1-3,阳性对照组,单染anti-CD42b-FITC

阳-1-3,阳性对照组,单染anti-CD42b-FITC

这是我的阳性和阴性对照组,感觉测的不太对,阳性组结果偏低,阴性组结果偏高,不知道设门是否合理,麻烦大神帮我分析一下吧,多谢啦
发表于 2019-1-7 14:00:13 | 显示全部楼层
XY星雨XY 发表于 2019-1-5 23:02
这是我的阳性和阴性对照组,感觉测的不太对,阳性组结果偏低,阴性组结果偏高,不知道设门是否合理,麻 ...

貌似没看到阳性表达呀?CD42b,CD62p,血小板marker。你是检测血小板样本吗?还是其他什么样本?

血小板样本的话,FSC/SSC图就不对了,一般要用对数来圈选的。
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

流式中文网    

联系我们: mail#flowcyto.cn (#改为@)

GMT+8, 2019-6-16 18:35

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.