CTL Teff 肿瘤免疫流式分析

默背你的心碎

  首先呢，http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6635-1-1.html 这个是Treg可用CD3、CD4、CD25、FoxP3 至于Teff等亚群，中文网的专门的帖子，留给我和我一样的肿瘤免疫菜鸟可以先看看，分型什么的。
  我目前想问的是稍微更详细一点的问题：
  1） Foxp3的染色问题， http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1211-1-1.html   中文这里讲的很详细，但是我想再确认下，所用的破膜剂是 biolegend 的        True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set  424401 ，这款吗？
  2）因为国外的师兄说小鼠脾脏肿瘤等细胞研磨后可以4%多聚甲醛固定后放置，所以都是先固定了再测 CD3，CD4，CD8的，然后再破膜测Foxp3，这样设计实验顺序可以吗？ 还有就是不太能理解  http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6635-1-1.html 里面讲解的 设门步骤，和教研室的小伙伴讨论后目前有两个思路：
1.按照之前说的讲解的那种步骤，先选出CD3细胞，再分出CD4，CD8；然后在CD4阳性里面再分 Foxp 3 淋巴细胞，但是这样设计有点搞不懂 FSC SSC那里圈出淋巴细胞这个有什么具体的指标；还有我是 CD3（FITC），CD4（PerCP），CD8（APC），Foxp3（PE） 四染，那怎么选出CD3细胞，是直接建一个柱状图（机器是BD FACSCelestaTM ）选择荧光强度高的右边的峰即可吗? 如果有明显两个峰的话
2.就是直接先单独测每个细胞各通道的荧光强度，然后再用软件后期分析。。。。。
目前就是比较纠结该怎么设门去测定。。还望大神们来指点指点。。
弱弱的再补一个 PerCp，PerCP-cy5.5 的激发光和发射光查了之后感觉很接近啊，没什么差别啊

niwanmao

1、目前看来，FoxP3效果反馈最好的还是Thermo的foxP3抗体和破膜剂。
2、可以先固定，如果要固定较长时间，建议用1～2％低浓度的。染色时先染表面标记，再进行破膜测核内foxP3，分析步骤可参照：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6041-1-1.html

默背你的心碎

非常感谢 站长的回答，非常精准有效。。

默背你的心碎

赶着预试了一下，测的是小鼠的 脾脏，没有给药，所以默认它是正常的，还有B16F10 肿瘤（异位接种在小鼠上）研磨后的细胞；上机的时候就是直接测各通道的 荧光强度（用没染的细胞作为control，），回来后用 Flowing 分析的，参照中文网上的设门方法，就是先SSC FSC 框选细胞，SSC-A  FITC-A（CD3+）框选T细胞，然后就直接 看 APC-A（CD8），PerCP（CD4）。 不过不知道为什么没有观察到 那种很明显的 CD4 CD8的细胞分群。。。有点不太清楚。。
染色的步骤： 细胞悬浮于PBS中，加入各对应的抗体，我的稀释比例都是 1:100；都是用的Biolegend的 anti-CD8a-APC  2μg/ml  anti-CD4-PerCP  2μg/ml
anti-CD3-FITC   5 μg/ml。。
这算是另一个问题了，但联系比较紧密所以放在一起嘛，也方便后来的同志一起看，不过我追加流星的。。。

niwanmao

默背你的心碎 发表于 2018-12-12 10:38
赶着预试了一下，测的是小鼠的 脾脏，没有给药，所以默认它是正常的，还有B16F10 肿瘤（异位接种在小鼠上） ...

像是死细胞。
你如果往里面加一个死活染料（例如PI），将死细胞排除掉，就能看出问题所在了。

默背你的心碎

倪老师，这个肯定是死细胞啊，我用4%多聚甲醛固定过的啊，还是您说是收集的时候细胞状态是死亡的。
这个肿瘤组织，我是直接解剖的 荷B16F10瘤的小鼠取的，取了之后立马过细胞筛网制备样品的，可能里面是有些坏死的细胞，但是因为样品接下来有点多，所以就直接固定了，固定了之后就没法排死活细胞了。
主要脾脏也是新鲜的，解剖之后就立马制备成单细胞悬液固定了。   但是总感觉这个细胞很贴近 原点，被压的很低很奇怪，跳过电压也调不上去，FSC SSC 各种组合也试过了下。
您说有没有可能是 没有加入 anti-mouse-CD16/32  去封闭导致假阳性，所以分群不明显的呢？

niwanmao

默背你的心碎 发表于 2018-12-13 16:55
倪老师，这个肯定是死细胞啊，我用4%多聚甲醛固定过的啊，还是您说是收集的时候细胞状态是死亡的。
这个肿 ...

固定后的细胞不叫死细胞，那是固定后PI染色假阳性的细胞。

从你这里的描述看，调节电压无效，那么考虑是一些碎片信号了。

默背你的心碎

好的，好的，谢谢站长了，我再自己想想，再试试，争取弄出来，到时候把一些细节分享出来，共同进步

niwanmao

默背你的心碎 发表于 2018-12-14 17:36
好的，好的，谢谢站长了，我再自己想想，再试试，争取弄出来，到时候把一些细节分享出来，共同进步 ...

每次出点结果，都可以再放上来讨论。慢慢可能就会有眉目。
你在解离组织的时候，是用酶消化还是机械法？

默背你的心碎

恩，好的好的，建立方法的过程是需要探索下的，也可以方便其他站友一起进步。
我在解离组织的时候，是用的机械法，直接过 40 μm的细胞筛网，然后离心收集细胞，4%多聚甲醛固定后，重悬于PBS中保存于4℃冰箱。