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[流式分选] ser473磷酸化流式细胞术

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发表于 2019-1-11 09:49:21 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
您好!最近做造血干细胞磷酸化(ser473)流式。破膜用的BD perm3(包含86%的甲醇)。ser473结果不稳定,有时染的上,有时染不上。今天破膜提高到70分钟,ser473也没有染上。做了快20次了,不知道问题出在哪里?期待您的回复。

发表于 2019-1-12 19:04:34 | 显示全部楼层
你可以试试不同甲醇浓度。pAKT也有可能不适合86%甲醇:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6525-1-1.html
 楼主| 发表于 2019-1-14 17:22:12 | 显示全部楼层
1.固定后蛋白也会去磷酸化,也会降解?
2.如果第1条成立的话,固定后操作时间长的话,应该信号可能就会没有?而不是取决于标记核抗体后放置的时间?
 楼主| 发表于 2019-1-14 17:23:32 | 显示全部楼层
流式标记的核抗体会可逆吗?而不是因为蛋白去磷酸化,或者降解。
发表于 2019-1-14 22:42:29 | 显示全部楼层
Wlmedicine 发表于 2019-1-14 17:23
流式标记的核抗体会可逆吗?而不是因为蛋白去磷酸化,或者降解。

想多了。
发表于 2019-1-15 22:53:32 | 显示全部楼层
Wlmedicine 发表于 2019-1-14 17:22
1.固定后蛋白也会去磷酸化,也会降解?
2.如果第1条成立的话,固定后操作时间长的话,应该信号可能就会没有 ...

我记得我以前看到过磷酸化流式的材料,大概意思是说:磷酸化状态不会持续太长时间的,随着时间的推移,相关蛋白会逐步讲解的。
请问一下你用的是什么试剂固定呢?
 楼主| 发表于 2019-1-16 06:36:56 | 显示全部楼层
4%甲醛。同一管样品我测到了磷酸化信号从有到无。
发表于 2019-1-16 15:01:59 | 显示全部楼层
Wlmedicine 发表于 2019-1-16 06:36
4%甲醛。同一管样品我测到了磷酸化信号从有到无。

如果是不同时间的检测,这是蛋白的去磷酸化。如果是你标记之后放置在那里,隔段时间测一次,我个人觉得更大的可能性是荧光素的淬灭,而不是你前面说的流式标记核内抗体的可逆过程。
 楼主| 发表于 2019-1-16 16:07:48 | 显示全部楼层
核标记的流式抗体和表面标记的流式抗体,也需要调节补偿?
 楼主| 发表于 2019-1-16 16:08:58 | 显示全部楼层
看直方图,如果把电压调大,视觉上觉得差别会明显些。但如果需要和表面marker一起调节补偿,电压就不能调节的那么随意。所以问题,核抗原和表面抗原一起标记,它们之间需要调补偿吗?

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