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原理：
最新一代一氧化氮荧光检测探针DAF-FM DA (3-amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate)，在提供充足的底物的条件下检测细胞内的一氧化氮合成酶可以催化产生的一氧化氮量，从而检测出一氧化氮合成酶的活性。采用一些一氧化氮合成酶的抑制剂则可以测定出特定类型的一氧化氮合成酶的活性。例如，采用iNOS抑制剂，未加iNOS抑制剂测定出来的酶活力减去加了iNOS抑制剂测定出来的酶活力就是iNOS的酶活力。
样品的检测：
细胞或组织内一氧化氮合成酶的活性检测有如下两种方法：
a. 边刺激边测定。对于短时间药物等刺激(通常2小时以内)可以显著提高一氧化氮合成酶活性的情况可以使用本方法。吸尽培养液，加入100微升NOS检测缓冲液。如果是悬浮细胞，可以将96孔板离心后吸去上清，或将生长良好的细胞直接从培养的器皿中离心收集后按照适当密度用NOS检测缓冲液重悬后，按照每孔100微升均匀加入到96孔板中。再加入100微升检测反应液，轻轻混匀。37℃细胞培养箱内孵育20-120分钟。具体孵育时间因不同的刺激和不同的细胞而不同，需自行摸索。对于经典的LPS和γ-IFN共同刺激RAW 264.7细胞，诱导一氧化氮合成酶活力的提高，孵育120分钟后检测，可以观察到刺激前后总的一氧化氮合成酶活力提高6-10倍。直接取该96孔板用荧光酶标仪检测。以没有细胞的孔为空白对照，激发波长为495nm，发射波长为515nm。用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪也可以进行检测。
b. 先刺激后测定。对于需长时间刺激(通常6小时以上)才可以显著提高一氧化氮合成酶活性的情况可以使用本方法。细胞或组织刺激后，吸尽培养液，加入100微升NOS检测缓冲液。如果是悬浮细胞，可以将96孔板离心后吸去上清，再加入100微升NOS检测缓冲液。再加入100微升检测反应液，轻轻混匀。37℃细胞培养箱内孵育20-60分钟。具体孵育时间因不同的刺激和不同的细胞而不同，需自行摸索。直接取该96孔板用荧光酶标仪检测。以没有细胞的孔为空白对照，激发波长495nm，发射波长为515nm。由于波长的设置和FITC检测时的波长设置非常接近，可以直接使用FITC的设置。用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪也可以进行检测。
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发表于 2011-3-10 15:20:21
发表于 2011-4-7 10:35:08
