CD69质控问题

CRP

请教各位老师和高手，这是我今天做的CD69质控实验，表面CD69和胞内CD69的检测，问题很多

其中，FL1是CD3，FL2是CD69，从图上看，表面的活化度只有12.87%，而胞内的大约是47.78%，问题

1. 我的检测方案合适吗？先做的是SSC-CD3散点图，再以CD3圈门，在检测CD69的表达（直方图或者二维图中）

2.活化度还是很低，没有像大家说的90%以上，而且表面的竟然比胞内低？

3.还有什么不合适的请大家指教。

下两幅图只有刺激样品，对照都很少不到1%。

niwanmao

你这细胞状态不对啊，FSC-SSC图看上去都是碎片或者状态不佳的细胞。是不是PBMC没有提好或者养坏了？镜下看看吧。

CRP

niwanmao 发表于 2012-4-25 12:12

                               
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你这细胞状态不对啊，FSC-SSC图看上去都是碎片或者状态不佳的细胞。是不是PBMC没有提好或者养坏了？镜下看 ...

细胞没有问题，实验前我有在镜下看的

CRP

CRP 发表于 2012-4-25 14:10

                               
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细胞没有问题，实验前我有在镜下看的

这个是BC的xl做的

niwanmao

CRP 发表于 2012-4-25 14:10

                               
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细胞没有问题，实验前我有在镜下看的

是在标本处理前还是上机前。我们这边曾经有研究生做RAJI细胞株的细胞周期，处理之前，状态很好，但一加入PI染液，马上全碎掉，染液配制也没有问题。
我看你这里的CD3表达很不集中，按照平时我们做的淋巴细胞表达情况，CD3的荧光应该是比较集中的。所以，我在怀疑你的细胞状态问题或者是提取的纯度问题。

CRP

niwanmao 发表于 2012-4-25 14:23

                               
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是在标本处理前还是上机前。我们这边曾经有研究生做RAJI细胞株的细胞周期，处理之前，状态很好，但一加入 ...

细胞好着呢，我刚才看了剩余的细胞，现在还好着呢

您看我的检测protocol正确着吗？

另外对于CD69的表达，一定是指的是CD3（T细胞）中的表达吗？

第二幅图的表面染色似乎细胞好一些，估计胞内离心次数太多造成的，下次我调整一下转速

niwanmao

CRP 发表于 2012-4-25 15:19

                               
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细胞好着呢，我刚才看了剩余的细胞，现在还好着呢

您看我的检测protocol正确着吗？

验证活化是否成功，就是看t淋巴细胞的cd69，而t细胞的最明显标记就是cd3。所以肯定是分析cd3阳性细胞的cd69表达。
你的细胞因子染色步骤如何，是不是可以放上来讨论一下？

nsync4

第一幅图的CD3很强啊，我也用XL,很少表达这么强的。先看一下T淋巴细胞所占比例，个人感觉你的细胞中肯定是有细胞碎片的。刺激体系也是很重要的，通用的是PMA和离子霉素，还有透膜剂的选择也很重要。

CRP

nsync4 发表于 2012-5-2 22:36

                               
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第一幅图的CD3很强啊，我也用XL,很少表达这么强的。先看一下T淋巴细胞所占比例，个人感觉你的细胞中肯定是 ...

可能是有细胞碎片，但是在SSC-FL1图里，我的死细胞碎片和CD3阳性细胞是一团的，根本没有办法区分，活化率低我也想到这个问题

请问您做这个的检测流式的protocol和我的一样吗？就是上述的四个图片吗?我担心我的检测设置是否出问题

CRP

niwanmao 发表于 2012-4-25 22:14

                               
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验证活化是否成功，就是看t淋巴细胞的cd69，而t细胞的最明显标记就是cd3。所以肯定是分析cd3阳性细胞的cd ...

倪老师，我说的是上流式检测的protocol？染色应该问题不大