|
悬赏3流星未解决
本帖最后由 shunlifasci 于 2021-7-21 11:24 编辑
各位老师好,我做的是人外周血分离的原代T-B细胞共培养体系,检测药物处理该体系后胞内因子的变化。
实验步骤:1.Ficoll分离人外周血PBMC,磁珠阴选B细胞、阳选T细胞。2、将分选的B细胞分三管(编号:①②③),①管B细胞培养3d检测表明marker(10%FBS培养,无活化剂),②管B细胞在anti-IgM+CD40L+IL4条件下活化5d,检测胞内因子变化;③管的B细胞先用anti-IgM预处理48h后与T细胞共培养(体系含包被的anti-CD3/CD28),5d后检测T、B细胞胞内因子改变。
②③管检测胞内因子时,用PMA+离子霉素刺激4-6h(加入BFA和莫能菌素)——洗,染色死活—Fc block—染色表面CD19,20min—(ebiosceice试剂)固定破膜液500ul 30min——1ml破膜buffer,500g,5min——染色胞内因子——洗,上机分析。
目前问题:同样的分选后的B细胞,管①染色后分析约85%以上的B细胞,管②管③分析B细胞,仅约个位数。比较了下不同管之间的操作,CD19抗体相同(BD,BB700-CD19),最大差异就是经历PMA刺激和固定破膜操作。
试问:固定破膜对CD19影响这么大?我需要固定破膜后再染色CD19嘛,老师们有这方面经验嘛?
|
-
表染CD19-大多数仍是B细胞
-
表染CD19+固定破膜-很少的CD19
-
同管2,固定破膜后很少的CD19
|