新手，流式问题，急呀！！！！！！

samly0

倪老师说得对，刺激还是遵循最佳时间点好点，只能辛苦点在流式上机前5个小时，半夜跑到自己单位加刺激了，有时候做科研就是这样，时间不管怎么调整都要牺牲休息时间。或者你可以做次预时间比较下刺激5个小时和刺激一个晚上的结果，看看差别大不大。

niwanmao

samly0 发表于 2012-12-18 10:24:30

                               
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倪老师说得对，刺激还是遵循最佳时间点好点，只能辛苦点在流式上机前5个小时，半夜跑到自己单位加刺激了，

科研是很累，当年我曾经睡在实验室，就为了收一批药物作用的细胞，因为时间点没法避开半夜。但是如果试验结果好，那种兴奋劲什么都没法比。

@雨田 ，建议你按照@samly0 说的，可以先对比下，没有差别才可以延长刺激时间。但我估计可能性很小。

雨田

恩，试试看，谢谢两位老师。

雨田

niwanmao 发表于 2012-12-18 11:41

                               
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科研是很累，当年我曾经睡在实验室，就为了收一批药物作用的细胞，因为时间点没法避开半夜。但是如果试验 ...

老师好：再请问一下，用新鲜全血加红细胞裂解液后检测th17和分离提取淋巴细胞后检测th17有无明显差别？今天去找做流式的老师他说现在国外流行用新鲜全血加红细胞裂解液后检测，我查了近来的中文文献基本都是分离提取淋巴细胞后检测，没有找到用全血的，所以请教一下老师您了，谢谢！还有实验样本的估算方法你能告诉我一下吗？

niwanmao

雨田 发表于 2012-12-25 19:41

                               
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老师好：再请问一下，用新鲜全血加红细胞裂解液后检测th17和分离提取淋巴细胞后检测th17有无明显差别？今 ...

我觉得他可能误会了你的意思，以为你是直接用抗体标记检测Th17，实际上你需要先分离PBMC然后再刺激最后检测Th17，直接全血培养似乎也听说过，但由于红细胞干扰，估计结果应该影响挺大，具体没有比较过。

renping_jsnj

这里做Th1/Th17实验的同学挺多的，分享一个我自己用过的实验试剂。  Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™: BD Pharmingen,  Cat. 550583。这里PMA，离子霉素，和蛋白转运抑制剂都是按比例加好的，买回来直接使用，不存在配制等问题。我用的效果还可以。
纯个人推荐，不是广告贴。

renping_jsnj

用全血还是PBMC的问题，个人觉得除非楼主的实验是要最大程度模拟体内的情况，如血浆蛋白结合等，否则还是用PBMC更好一些，因为全血当中的各种细胞成份、抗体、因子对实验的影响很大，包括对你实验条件、实验结果的影响，还有对你最终分析数据的影响。所以不是只问全血能不能做得出来，还要问全血做的结果对你有没有帮助。如果没有，那果断用PBMC吧。
时间的问题，在这个实验里面刺激只是其中一部分，楼主还要考虑之前的血样处理，刺激后的染色按照先表面再胞内的分步染色时间至少也要安排2-3h。所以建议楼主将实验从头到尾的步骤一步步列出来，包括每一步时间耗费多少，这样才知道如何安排。
我当初做这个实验也纠结加班的问题，后来发现拿到好的结果最重要。