求助双染做凋亡问题！

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-18 22:36

                               
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是的，是不是有可能是消化细胞时造成的细胞破碎呢？可是从FSC-SSC看的话，细胞还是有形态的呀！ ...

我的意思不是说由于消化导致细胞破碎，细胞是完整的，FSC/SSC的图也挺漂亮的，但是贴壁细胞受消化影响还是挺大的，所以AV-PI是很难做。其实象贴壁细胞，可能做细胞周期更好一些。

不过你这个实验是补数据，所以暂时也不可能换其它方法了。从结果看，PI染得太厉害，AV虽然分群不清楚，但勉强能够分析，所以重点是减少PI染上的比例，接下来是否可以从消化上着手解决？例如减少消化时间，或者很短的消化时间加上轻轻吹打。

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-18 22:40

                               
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嗯。。。头疼！
我记得您好像说过做双染凋亡的时候贴壁细胞消化用的胰酶要不加EDTA的，为什么呢？ ...

将培养细胞用0.04％乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA·2Na）或0.29％胰蛋白酶消化3～7min（依据室温情况而定）  http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1503-1-1.html

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-03-18 22:44:24

                               
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我的意思不是说由于消化导致细胞破碎，细胞是完整的，FSC/SSC的图也挺漂亮的，但是贴壁细胞受消化影响还

有没有可能是pi浓度偏大了呢？<br />
我的细胞是内皮细胞，不太好消化，要是细胞不变亮变圆，根本吹打不下来！

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-03-18 22:44:24

                               
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我的意思不是说由于消化导致细胞破碎，细胞是完整的，FSC/SSC的图也挺漂亮的，但是贴壁细胞受消化影响还

单纯的从双阴区域的增加能说明保护作用吗？如果不能，只能重做了！

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-03-18 22:59:47

                               
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单纯的从双阴区域的增加能说明保护作用吗？如果不能，只能重做了！

单纯从双阴性区域说明，还真的没有见过。pi不是试剂盒里面已经配好的吗，浓度应该不用你自己调啊

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-03-19 06:53:19

                               
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单纯从双阴性区域说明，还真的没有见过。pi不是试剂盒里面已经配好的吗，浓度应该不用你自己调啊

会不会是pi染色时间太长了导致的？我上次做的时候是加完av后马上就加了pi，染色15分钟，我记得有战友说过pi染色五分钟就可以了。

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-03-19 06:53:19

                               
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单纯从双阴性区域说明，还真的没有见过。pi不是试剂盒里面已经配好的吗，浓度应该不用你自己调啊

又或者是我的双氧水浓度太大了，直接把细胞膜结构破坏掉了。

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-19 08:13

                               
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又或者是我的双氧水浓度太大了，直接把细胞膜结构破坏掉了。

PI染色时间15分钟和5分钟应该影响不大，我们那时候有些标本放了半小时都没这么多，可能还是细胞受破坏的缘故。我在想，是否可以在染AV-PI前，你取一滴细胞做个台盼蓝，看看细胞活力？

cccssszzz08

niwanmao 发表于 2013-3-19 10:07

                               
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PI染色时间15分钟和5分钟应该影响不大，我们那时候有些标本放了半小时都没这么多，可能还是细胞受破坏的缘 ...

哦 好吧！我试一试再说。如果尽量想必灭细胞受损，是不是消化的时候尽量温和一些呢？我也没有刮，机械损伤应该不会有的。

niwanmao

cccssszzz08 发表于 2013-3-19 10:55

                               
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哦 好吧！我试一试再说。如果尽量想必灭细胞受损，是不是消化的时候尽量温和一些呢？我也没有刮，机械损 ...

总之，这实体组织细胞、贴壁细胞做AV-PI确实很难很难。因为机械刮肯定会使细胞受损，而消化尽管不会使细胞破损，但可使细胞通透性增加。预祝好运！