有两个峰的直方图怎么分析？

cellprobe

cellprobe 发表于 2014-10-30 18:46
对的。我在摸索最佳浓度。肯定是抗体浓度的。问题。

倪老师，这是我又一次实验。我是在样品染色之后上机之前加7AAD的。但是这次做的细胞太多，加上染色的时间很长，所以死细胞很多，这样被7AAD gate掉的细胞自然就很多。因为死细胞很多，所以能分析的活细胞就少了，死细胞对荧光的影响自然就大了。所以这次有些图还是有明显的杂带。

关于什么时间加7AAD，有人认为是在抗体染色之前加7AAD；有人建议我在二抗染色的时候加7AAD，然后7AAD随二抗一起洗掉，这样被7AAD染上的细胞就少了。我不知道7AAD被洗掉后信号怎么变化？我觉得先前的实验证明非特异性峰是死细胞造成的，如果二抗和7AAD同时加，那么二抗染完以后死的细胞就不能被排除掉了。

我想在FACS buffer里面加FBS或者BSA减少细胞的死亡。

还有一个问题，本来我同时用到7AAD和PE。但是我没有做unstained control和single stained control。我用的是可以手动调节补偿的Calibur。我直接用双染的样品上机，手动调节补偿。我经验性的把荧光值小于10的划成活细胞；但是如果能看到两个界限很分明的活细胞和死细胞群，我会在分界线地方设门。倪老师，像我这样不设置单染对照，直接设门的做法可取吗？
问题非常多。谢谢了！

niwanmao

cellprobe 发表于 2014-11-6 12:37
倪老师，这是我又一次实验。我是在样品染色之后上机之前加7AAD的。但是这次做的细胞太多，加上染色的时间 ...

PE和7-AAD之间还是有补偿的，建议还是先做一下单染，以防止出现一些假阳性的峰。补偿不正确的话，结果也会出现无法解释的问题。

至于加7-AAD的时间，我觉得在抗体染完之后，上机前进行7-AAD更好。

cellprobe

niwanmao 发表于 2014-11-6 12:57
PE和7-AAD之间还是有补偿的，建议还是先做一下单染，以防止出现一些假阳性的峰。补偿不正确的话，结果也 ...

您觉得我还是应该做unstained control和single stained control，然后调节补偿。根据single stained control来划门设定7AAD阳性和阴性的。好的，我试试。不过做凋亡的时候做过单染觉得对设门没有什么帮助。

cellprobe

niwanmao 发表于 2014-11-6 12:57
PE和7-AAD之间还是有补偿的，建议还是先做一下单染，以防止出现一些假阳性的峰。补偿不正确的话，结果也 ...

倪老师，刚刚看了一些帖子，还是需要设置对照的。可是不太明白设门的依据。到底根据什么设门：是根据双阴性的样品设门，还是根据单染的样品设门？谢谢

跟细胞凋亡设门一样的，应该是根据双阴性设门还是根据PI/FITC单染的样品设门？谢谢

niwanmao

cellprobe 发表于 2014-11-6 15:50
倪老师，刚刚看了一些帖子，还是需要设置对照的。可是不太明白设门的依据。到底根据什么设门：是根据双阴 ...

做单染，既可调节补偿，又可设置MARKER位置。