请教多重染色时的补偿调整问题

小橘灯

从图上看，看不到阴性群。调补偿应该是，同一群细胞，有阳性的，有阴性的；根据阴性的，把阳性PE溢漏到PERCP-cy5.5的信号给调下来。CIK的话，CD8PE肯定有阴性的，你要不把X轴Y轴调出来看看，看阴性细胞和阳性细胞重心是否在同一水平线。
还有一点，你调完补偿之后，要根据FMO来设置阴性门，是不是CD45RA的阴性门根据CD8阳性调下来之后的那群来设阴性门会比较好
你调补偿时，其他电压应该没动吧

niwanmao

shinian 发表于 2016-3-21 14:53
补偿值调节的过程拍了一组照片

奇怪，你这是什么机器？这款软件从来没见过。

从问题中，我明白你想问的关键之处在于调节补偿后为什么CD45RA阳性率与单染时不一样。这其实涉及到门的设置，因为在你这个标本里面CD45RA分群并不好，所以你单染时根据直方图设置的门是否正确需要考量（还有，你叠加的阴性峰是什么标本？）。另一方面，从你后面的描述看，补偿是否调节到位你根本没有理解，我给你的帖子你根本没有仔细读就说跟你理解的一样，所以过度补偿，也是会影响此比例的。

如何调节正确的补偿，此处我暂时不说，给你留个作业

shinian

小橘灯 发表于 2016-3-21 17:57
从图上看，看不到阴性群。调补偿应该是，同一群细胞，有阳性的，有阴性的；根据阴性的，把阳性PE溢漏到PERC ...

图二是CD8-PE，可以看到阳性80%以上，阴性的感觉已经在在坐标轴之外去了，不在阴性对照那个峰的位置，但是我的电压值没有改变过。

恩，下次试试增加FMO来做CD45RA的阴性对照看看。

shinian

niwanmao 发表于 2016-3-21 20:15
奇怪，你这是什么机器？这款软件从来没见过。

从问题中，我明白你想问的关键之处在于调节补偿后为什么CD ...

用的millipore的guava easycyte流式仪和软件。

如果要按照对比MFI值来确定补偿的话，我画了下图里面R14的门然后调整补偿值，使CD8-PE单染管的PerCP通道R14门内MFI值和isotype管R14门内MFI值大概差不多，得到的是这么个结果，这个看起来也还是不对啊。逐渐调高补偿值得过程当中，并不是整个峰逐渐左移，而是很多信号就直接被压到坐标轴外了，就是最左边那细长的一条，所以看起来好像整个峰信号比阴性对照明显要强，但是加上最左边那些信号一起得出的MFI值这个时候是和阴性对照差不多的。

单染管直方图是根据isotype阴性对照抗体染同样的细胞设定的门，我觉得起码CD45RA单染结果应该是准确的吧？

niwanmao

shinian 发表于 2016-3-22 20:35
用的millipore的guava easycyte流式仪和软件。

如果要按照对比MFI值来确定补偿的话，我画了下图里面R14的 ...

分群不清楚的话，单染亦未必是准确的。
我的建议是你把原始数据导出为FCS文件传上来，我们看了之后再讨论哪个准确，你觉得呢？

shinian

niwanmao 发表于 2016-3-22 21:52
分群不清楚的话，单染亦未必是准确的。
我的建议是你把原始数据导出为FCS文件传上来，我们看了之后再讨论 ...

好的 晚一点我把文件上传  谢谢啦

shinian

niwanmao 发表于 2016-3-22 21:52
分群不清楚的话，单染亦未必是准确的。
我的建议是你把原始数据导出为FCS文件传上来，我们看了之后再讨论 ...

6个fcs文件，包括一个isotype对照，四个单染，一个四色
请大家指点一下，多谢多谢

zhang4083

所以说，有些学生做试验，能单染的，我都建议他们单染。
不能单染的，最好的办法就是跨度比较的颜色应用。

补偿永远是流式细胞仪最不好整的东西。

越多色越难整。