Tfh细胞检测

niwanmao

wsgcc 发表于 2016-7-10 17:56
今天看到有的protocol中写流式染色液中加入2%的FBS,另外在重悬细胞吸打时为避免损伤细胞将枪头剪短。这样是 ...

加FBS，我认为主要还是起到封闭Fc受体作用。至于将枪头剪短，这种避免细胞损伤的想法可能只是个人臆想吧。

Victorrwang

wsgcc 发表于 2016-7-10 17:56
今天看到有的protocol中写流式染色液中加入2%的FBS,另外在重悬细胞吸打时为避免损伤细胞将枪头剪短。这样是 ...

重要的写在前面：你提到的这两个方法都不是解决问题的关键。加FBS是标准操作，可以降低背景。但是没加的时候检测不到tfh，加了后应该还是检测不到的。

2%FBS或者1%BSA是标准的staining buffer的配方，如果配置大量的buffer，并且要用很长时间的话，可以加0.05%的叠氮钠。
FBS或者BSA的作用都是降低general的非特异的染色。 枪头剪短在某些设计比较娇嫩的细胞的实验中确实会有用到，但是在这个实验中，并没有必要。

Victorrwang

wsgcc 发表于 2016-7-6 21:23
3幅图是分两次不同的实验，前2幅图用的是 BD的破膜液，最后那个用的是BD的Transcription Factor Buffer Se ...

如果只是检测cytokines，还是建议不要使用TF的buffer set。TF的buffer set并不一定兼容某些cytokines的检测，ebioscience好像有一个表，我一下子找不到，但是你可以自己搜一下。

讲一下你的实验：根据你的gating，应该只能算是th2细胞吧？没有cxcr5,pd-1不好乱叫的。
另外，你的细胞体外激活过没？如果没有激活，那我对那些IL-4＋的细胞要表示怀疑了

wsgcc

Victorrwang 发表于 2016-7-12 02:56
如果只是检测cytokines，还是建议不要使用TF的buffer set。TF的buffer set并不一定兼容某些cytokines的检 ...

多谢您的回答。
我的tfh细胞是设定的CD3/CD4/CXCR5/PD-1阳性的细胞。另外在IL-4的细胞因子检测中也是加了CD3/CD4/CXCR5检测的。
我的细胞在体外刺激了6个小时，用的是PMA/离子霉素加高尔基体。
TF的buffer是BD的技术支持建议的，因为我还检测Bcl-6这个核蛋白。看来确实不理想。
您说的那个BUFFER兼容表我看过，我在检测细胞因子时用的都是BD的破膜buffer,之前实验室里的研究生用它检测细胞因子没有问题。

Victorrwang

wsgcc 发表于 2016-7-12 09:28
多谢您的回答。
我的tfh细胞是设定的CD3/CD4/CXCR5/PD-1阳性的细胞。另外在IL-4的细胞因子检测中也是加了 ...

谢谢回复, 打消了我的疑虑。
如果两个要同时染确实可能有冲突. 另外体外刺激本身也会导致cxcr5和pd1表达的下调，从而影响这群细胞的百分比。所以还是要根据实验目的进行取舍

wsgcc

Victorrwang 发表于 2016-7-12 09:52
谢谢回复, 打消了我的疑虑。
如果两个要同时染确实可能有冲突. 另外体外刺激本身也会导致cxcr5和pd1表达的 ...

您好！感谢您的回复。
我在做CD3/CD4/CXCR5/PD-1进行表面染色的时候，还是比较顺利的。但是在做CD3/CD4/CXCR5/IL-4染色的时候，刺激后CXCR5单染还是很明显的，但是固定破膜后加上胞内的IL-4后，CXCR5就很低，IL-4也很低。所以很苦恼。最近还要再重复，不知在实验优化方面您有何建议呢？
Thanks a lot.

niwanmao

wsgcc 发表于 2016-7-12 10:55
您好！感谢您的回复。
我在做CD3/CD4/CXCR5/PD-1进行表面染色的时候，还是比较顺利的。但是在做CD3/CD4/C ...

如果像你这么描述的话，需要考虑破膜剂的问题了。