使用先固定破膜再染CD4效果差 望指教

小青菜

小灰 发表于 2017-3-1 11:17
一般流式操作顺序是：先标膜蛋白、再固定破膜、在标膜内蛋白。如果先固定破膜会造成膜蛋白丢失，含量低的情 ...

嗯嗯 主要PMA会引起CD4 下调 才想用这个方法的 我用下来未刺激组 CD4的标记 分群还是蛮明显的

小青菜

whyxa 发表于 2017-3-8 06:54
PMA刺激过的CD4T cell会造成CD4内翻，但我还没有用过破膜后染表面的，如果你刺激培养时间不超过4-12h的话， ...

我是细胞铺板后立马加刺激剂 约四小时后加蛋白抑制剂，再孵育十六小时。我这样可以先染色么？ 我的(⊙﹏⊙)未刺激组 先固定破膜再染色CD4 分群还蛮明显的 不知道你的为啥不行

whyxa

小青菜 发表于 2017-3-8 05:53
我是细胞铺板后立马加刺激剂 约四小时后加蛋白抑制剂，再孵育十六小时。我这样可以先染色么？ 我的(⊙﹏ ...

可以都先染CD4的，但是你这个加过蛋白抑制剂在孵育十六个小时啊，我印象中蛋白抑制剂一般4-6小时，过长对细胞由毒性，你可以细胞铺板后直接染CD4，surface 染好之后，在进行后续操作

小青菜

whyxa 发表于 2017-3-8 23:53
可以都先染CD4的，但是你这个加过蛋白抑制剂在孵育十六个小时啊，我印象中蛋白抑制剂一般4-6小时，过长对 ...

嗯嗯 那我想请问下 那染色CD4后也需要洗涤的对吧  就是铺板染色 染色CD4 30min 然后要对它洗涤么？ CD4染色结束后加刺激剂对么  您有相关的步骤么？具体的步骤我怕有误差  bFA我之前都是孵育的16h，说明书上说不超过24小时 没关系 相关文献也有加BFA 然后孵育18h 我觉得应该没事

whyxa

我不知道你的铺板细胞数量是不是有限制，你可以先在管上染好CD4之后在铺板，要洗涤的，在管上染好CD4，洗涤后，后续的步骤跟你现在的一样就可以了

小青菜

whyxa 发表于 2017-3-10 00:41
我不知道你的铺板细胞数量是不是有限制，你可以先在管上染好CD4之后在铺板，要洗涤的，在管上染好CD4，洗涤 ...

嗯嗯 我今天做了个预实验 效果不错 但我在想先标记CD4的话，那些因为刺激增殖的新的淋巴细胞 不就没有被标记CD4么 这些细胞怎么办呀

whyxa

小青菜 发表于 2017-3-14 03:23
嗯嗯 我今天做了个预实验 效果不错 但我在想先标记CD4的话，那些因为刺激增殖的新的淋巴细胞 不就没有被 ...

我个人认为短时间的培养，细胞扩增不会出现那么多，我没有做过24h细胞增殖的，检测刺激细胞因子，我一般都是控制在6h以内，如果检测增殖，我用CFSE标记会培养7d，24h细胞可能会有增殖存在

niwanmao

小青菜 发表于 2017-3-14 19:23
嗯嗯 我今天做了个预实验 效果不错 但我在想先标记CD4的话，那些因为刺激增殖的新的淋巴细胞 不就没有被 ...

先标记后，新增殖的也会有，但荧光强度降低，因为是由原细胞分裂而成。
但是我想不通，为什么你原来的方法会标不上CD4，是不是你用的CD4克隆号有问题，这种情况还是比较常见的。