流式测线粒体膜电势

maple032023

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我又做了一次,测了加药作用0,6,12,24小时的Rh123膜电势检测,跟上次差不多,随着时间的增高荧光逐渐增强..可是我的药物在24小时的时候就可以看出明显调亡,48小时调亡已经达到将近50%.一般来说导致调亡了电势膜应该降低啊!所以我觉得药物肯定应该有作用的啊!
至于背景是否洗净,这点我真不太确定.我按照我一个朋友的方法,1mlPBS细胞悬液里面加了10微升rh123 1mg/ml储备液(终浓度10微克/ml),加进去之后能看见细胞悬液明显变绿,这个量是不是太多了呢(我的是hela细胞)？37度30分钟后用PBS洗两遍(离心条件:300g 5min),但是仍然可以看见离心下来沉淀在管底的细胞呈红色.再用PBS悬浮之后就没有颜色了.就直接测了.你说这是没有洗干净吗?但是我觉得要是没洗干净就都没有洗干净啊,哪能只有加药的没洗净的道理呢?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-12 12:47

                               
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我又做了一次,测了加药作用0,6,12,24小时的Rh123膜电势检测,跟上次差不多,随着时间 ...

下面表格中是罗丹明123的化学特性，我按照罗丹明123的分子量，算了下，与protocol（http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=200）相比，你的储存液浓度2.6mM，高26倍，工作液终浓度是26μM，高2倍多。

Synonym:	2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester
CAS Number:	62669-70-9
Linear Formula:	C21H17ClN2O3
Molecular Weight:	380.82
Beilstein Registry Number:	6030951
EC Number:	263-687-8
MDL number:	MFCD00012664
PubChem Substance ID:	24899403                                 登录/注册后可看大图

因此，我觉得会不会是因为浓度过高的问题。即使储存液不管它，至少工作液的浓度应该还是不要高这么多。另外，储存液需要用甲醇充分溶解，不知道你是否也是这么做的？

maple032023

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我是用水制备的储备液,因为之前人都用水溶解的,没有问题.储备液浓度1mg/ml也都可以溶解.就是工作浓度我也不确定,我是看文献上都用10mg/ml,我也就这么做的.可是洗了两遍之后沉淀下来的细胞还是能看见红色,我也怕是不是没洗掉呢?不过无论是control还是加药组都一样,都能看见细胞是红色的.不过我通过ＳＳＣ和ＦＳＣ图上可以看出细胞变大．我觉得细胞变大也有可能导致荧光增加．所以总体来说如果是ｃｏｎｔｒｏｌ组合加药组都没有洗净，而且加药组细胞变大导致荧光增加，也可以解释这个结果．不知道我这么想有没有道理？
如果我分析的有道理，那我就还是应该重复一遍，工作浓度降低一倍，５ｍｇ／ｍｌ，再试一下．主要是如果染色后洗干净了是不是细胞应该是跟没染色的细胞一样，都无色，不应该看出红色的呢？我是不是这一步出了错误？还是应该我多洗几遍呢？我朋友做过说洗两遍应该没有问题了啊

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-12 20:03

                               
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我是用水制备的储备液,因为之前人都用水溶解的,没有问题.储备液浓度1mg/ml也都可以 ...

看来Hela细胞的R123检测结果的荧光就是如此不稳定，分析时正常细胞峰的位置是会发生变动的。是应该分析左侧的峰的，你看这篇文章页码为1626的那一页图片：http://www1.syphu.edu.cn/jpk/hxzygyx/materials/3-4-2/21.pdf，分析左侧峰的比例，即可反映出线粒体膜电位的DISRUPTION。