谢谢倪老师,还想请教一下未激活的细胞是也要在培养基中培养72h,只是不加激活剂对吧?因为我这都是同一批血提的细胞。以下是我设置的protocol,还希望老师能看看给点建议,谢谢!
CFSE检测CD8+T细胞增殖
1、 磁珠分选CD8+T细胞(正常人/患者),37℃预热PBS/0.1%BSA调整细胞浓度至2x10^6/ml
2、 CFSE原液 (10mM):1瓶CFSE加入18μl DMSO溶解,-20℃避光保存
3、 CFSE工作液(5μM):37℃预热的PBS/0.1%BSA将CFSE 原液(10mM)稀释为5μM的工作液
4、 取500μl调整好浓度的单细胞悬液与500ul CFSE工作液混合(终浓度2.5μM),37℃避光孵育10min,每隔一段时间上下颠倒混匀细胞
5、 加入5倍体积含10%FBS的RPMI 1640,在冰上孵育5分钟以终止染色
6、 300g, 5min离心,去上清,PBS洗涤3次,1ml 1640重悬后加入24孔板,加入25ul CD3/CD28激活剂,培养72h
7、 收获细胞,300g离心5min,去上清,buffer洗涤2次,加100ul buffer重悬,加入anti-CD8-APC 5μl,4℃避光孵育30min
8、 1ml buffer重悬,洗涤2次,最后用500μl buffer重悬,300目尼龙网过滤后上机
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