流式细胞术补偿调节9条准则

peansant

origin of these rules (english edition)

peansant

“Rule 2”中，调补偿的对照样本必须含有阴性细胞群和阳性细胞群，以便比对median。
“Rule 9"中，补偿微球可以替代细胞。
版主另一个帖子”[图片]从一幅图看补偿是否调整到位“ http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2890-1-1.html。
      
     那么，若我有一类细胞，需要8种表面标记物加以鉴定，其中4种是阳性表达，4种是阴性表达（见附件1），问：
1.我培养出该细胞之后，应该如何调节补偿？4种阴性表达抗体的单染管中，荧光应该很难检测，阳性细胞群细胞数目估计很少，是否会影响补偿；
2. 若用补偿微珠替代4种阴性表达抗体的单染管，是否效果更佳？
3.该类细胞比较难培养，想尽量用补偿微球替代，选择补偿微珠时是否有讲究？之前用补偿微珠（见附件2）替代，那边操作仪器的老师说跟我细胞差异太大，不能调补偿，没搞懂啥意思。
4.若没有单染管的信息，只有8种抗体加在一管里的那个DATA和未加抗体的那管的DATA，可以分析补偿调节是否到位吗？结果见附件4。

附件1：抗体信息

mMSC Antibody panal:

CD44+ CD90.2+ CD105+ Sca-1+  

CD31-  CD34-  CD45-  CD11b-

品牌	货号	名称	规格	检测通道
Miltenyilbiotec		CD105-PE		FL2
Miltenyilbiotec		CD45-APC		FL6
BD Pharmingen	560452	Ms CD44 V450   0.025 mg IM7	25 ug	FL9
BD Pharmingen	562058	MS LY-6A/E FITC MAB 0.025MG D7	25 ug	FL1
Biolegend	102417	PE/Cy7 anti-mouse CD31 Antibody	25 ug	FL5
Biolegend	128607	PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD34 Antibody	25 ug	FL4
BD Pharmingen	562317	MS CD11B PE-CF594 MAB 0.025MG M1/70	25 ug	FL3
Biolegend	105327	APC/Cy7 anti-mouse CD90.2 Antibody	25 ug	FL8

流式仪器：Gallios 10色 （附件3）

niwanmao

peansant 发表于 2014-8-8 11:09
“Rule 2”中，调补偿的对照样本必须含有阴性细胞群和阳性细胞群，以便比对median。
“Rule 9"中，补偿微球 ...

补偿微球我没用过，但从站内站友的讨论（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2560-1-1.html）看的出，应该基本上可以用补偿微球来调节补偿，其补偿值近似淋巴细胞，但如果较大的细胞，或许会有轻微变动。

flyer625

想问一下，单染管作补偿时，除了所加抗体的通道，其他通道要调到一点荧光信号都没有吗？按理说单个通道多少都会有少量光投到其他通道去，怎么样避免过补偿的情况呢？

niwanmao

flyer625 发表于 2014-8-12 16:56
想问一下，单染管作补偿时，除了所加抗体的通道，其他通道要调到一点荧光信号都没有吗？按理说单个通道多少 ...

补偿是否到位，关键看median ： http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2890-1-1.html

cdm874386070

niwanmao 发表于 2014-6-6 19:48
同一荧光素的抗体，结合效率不同影响的是荧光强度，而不是补偿。
compbeads可以帮助确定补偿的大致值，对 ...

倪老师，我请问下电压跟补偿有什么关系呀？如果调FCS和SSC的电压，会对其他补偿有影响吗？

niwanmao

cdm874386070 发表于 2017-7-3 09:47
倪老师，我请问下电压跟补偿有什么关系呀？如果调FCS和SSC的电压，会对其他补偿有影响吗？ ...

FSC和SSC的电压不会影响，指的是荧光通道的电压会影响到补偿，所以存在一个最佳电压的问题，站内曾经发过关于电压优化的会议PPT照片以及相关资料。

cdm874386070

niwanmao 发表于 2017-7-3 18:14
FSC和SSC的电压不会影响，指的是荧光通道的电压会影响到补偿，所以存在一个最佳电压的问题，站内曾经发过 ...

谢谢，倪老师的耐心回答

zj8237277

倪老师，请帮解答。谢谢！

第3条、可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检测时）。       为何还可以用别的抗体来替换呢？ 而且是要选用更高表达量的呢？
第7条、阴性和阳性细胞的自发荧光水平必须一致。        这如何去评判是否一致呢？  

另外，荧光补偿的计算原理是？

niwanmao

zj8237277 发表于 2017-7-28 16:37
倪老师，请帮解答。谢谢！

第3条、可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检 ...

第3条，为什么一定要选择高荧光强度的调节补偿，请参见近些日子发过的另一篇帖子：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6018-1-1.html

第7条，判断一致的标准就是两群细胞的Median值。