请问细胞PMA刺激后怎么处理能放置1-2天再测且不影响检测？

youyoufang

niwanmao 发表于 2011-9-16 11:46

                               
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我只是帮别人检测过，刺激没做过，但相关方案资料本站里面已有：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?m ...

谢谢了～～～～

liliqianyi

sugarswallow 发表于 2011-4-11 16:05
实验结果分享：
用了上述几个条件做实验：结果如下：
1.不影响试验结果的方案：

你好   请问你的刺激剂浓度怎样加的   我用的ebioscience的刺激剂，是PMA、ionomycin、BFA的混合物，浓度是固定的。之前做了一次，基本上没测到胞内的因子。

现在正在找原因，我看了大家的刺激剂的浓度好像不太一样，倪老师上传的资料中至少人和小鼠的相同因子的刺激剂浓度都不一样，请问这个影响大吗？

还有，我上次的血标本是培养一夜后再刺激染色的，拿到的标本不能及时刺激，培养或4度冰箱是否影响很大？
嗯  决定再按您的方法新鲜标本刺激染色一次，请您在样品刺激上多予指导!!!

爱白衣杀手

aninawang 发表于 2011-4-6 20:03
上述的方法没有完全实验过，不过有如下体验：1.分出PBMC放培养基过夜，刺激，染色；2.如果时间来得及，包膜 ...

穿膜过夜的时间很难统一，每次穿膜时间不同会不会对结果有影响呢？

niwanmao

爱白衣杀手 发表于 2015-3-20 09:52
穿膜过夜的时间很难统一，每次穿膜时间不同会不会对结果有影响呢？

一般应该固定过夜才靠谱。破膜过夜不好。

guanyu

sugarswallow 发表于 2011-4-11 16:05
实验结果分享：
用了上述几个条件做实验：结果如下：
1.不影响试验结果的方案：

1法，先染表面标志，然后用多聚甲醛固定，再用PI染核，
求问多聚甲醛固定时间温度（不需要保存，做完了直接就测）

niwanmao

guanyu 发表于 2017-12-1 11:17
1法，先染表面标志，然后用多聚甲醛固定，再用PI染核，
求问多聚甲醛固定时间温度（不需要保存，做完了直 ...

终浓度1％，固定10～15分钟，室温。

楚雪菡

niwanmao 发表于 2011-4-11 20:20
感谢分享。多聚甲胞醛固定后肯定会对表面抗原位点的构象有影响，因此第二种方法影响了CD4，而CD3可能其胞 ...

老师，现在我做的这个实验，染得是表面，因为我们需要收集不同的时间点（完全收集完需要3天的时间），之前一直采用的是先抗体4度避光孵育30min，之后再用PBS洗2遍，最后用4%的多聚甲醛和细胞悬液1:1固定，即多聚甲醛的终浓度是2%，我们看的就是随着时间的变化，这个表面抗原的表达量，理论上来说应该是表达量应该是随时间的增加，逐渐增多的，但是现在是到第三天流式结果显示是下降的，所以，在考虑是不是多聚甲醛的固定的问题（尤其是我们选择的浓度），我们是买的4%的组织细胞固定液，用离心管分装出来一部分放置4度使用。


还有就是，如果我选择处理完之后，就上机的话，如果样品量太多的话，做的时间长的话，是否有必要用多聚甲醛固定一下？

niwanmao

楚雪菡 发表于 2019-5-28 10:28
老师，现在我做的这个实验，染得是表面，因为我们需要收集不同的时间点（完全收集完需要3天的时间），之 ...

尽量收好就测，固定之后，荧光强度多少会发生变化，对于分群好的还好，分群不好的容易影响。

楚雪菡

niwanmao 发表于 2019-5-28 22:06
尽量收好就测，固定之后，荧光强度多少会发生变化，对于分群好的还好，分群不好的容易影响。 ...

那老师，如果我向收三天，然后同时上流式，如果要用多聚甲醛固定保存的话，固定的浓度是多少？保存的时间和条件是？

楚雪菡

楚雪菡 发表于 2019-5-29 15:42
那老师，如果我向收三天，然后同时上流式，如果要用多聚甲醛固定保存的话，固定的浓度是多少？保存的时间 ...

因为看到您在其他贴里回答的固定浓度说的都是1%，但是我们现在用的都是2%，甚至有的课题组用到了4%，所以在想，这个固定的浓度较为随意，不会产生多大的影响，还是浓度大了其实还是会对结果有影响的？