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这样的图形,你会如何分析?

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-7-10 20:12| 查看数: 1216| 评论数: 13|帖子模式

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下面这个图形,估计大多数人都会有同样的疑问,我已经将Fc受体阻断了,做的又是单色,邻近应该没有干扰,此时的未染色对照就等于多色里面的FMO了,这样设置门正确吗?
2019071101.png

设门原则是没错,但错在另一个关键点:抗体已经经过正确滴定。只有正确滴定过的抗体用量,才能采用这个设门位置。
但这个图中,我们明显看到阴性峰的非特异性荧光增强,为什么?因为CD3在淋巴细胞里面非阴即阳,所以可以确定
2019071102.png

因此,正确的设门位置应该如下图:
2019071103.png

CD3这种分群明显的标记好做,即使抗体未滴定好,门的位置也可以通过阴性峰、阳性峰的分界确定,但如果碰上下面这种分群不清的呢?
2019071104.png

同样进行Fc阻断之后,用未染色(单色实验时)或FMO(多色实验时)设门,见下面三幅图:
2019071105.png 2019071106.png 2019071107.png


同样,如前面所述,要用这个门来分析CCR7的表达,也是需要事先进行抗体滴定。
抗体的非特异性染色主要原因有两种:
  • 抗体与膜表面蛋白的非特异性结合
  • 由抗体浓度过高引起
    抗体滴定的目的就是为了找到最佳的浓度,在该浓度之下,阴性峰不会出现明显的非特异性染色,基本保持在未染色位置,同时,阳性峰能获得最强的荧光强度。
至于抗体滴定具体操作,请参考论坛上我们发过的两篇参考价值比较高的帖子:


最新评论

stf1990 发表于 2019-7-11 16:28:42
本帖最后由 stf1990 于 2019-7-11 16:31 编辑

学习了, 也就是说FcR 阻断剂是防止抗体与膜蛋白的非特异性结合,但在抗体过高浓度仍有可能导致阴性细胞群的非特异性染色?
stf1990 发表于 2019-7-11 16:37:01
倪老师,FcR是否在B细胞表达较多,T细胞表达较少,因我们组在对T细胞进行染色时,无论有没有FcR blocking进行阻断,染色结果基本无差别。
btx362237729 发表于 2019-7-12 11:49:38
所以找B淋巴细胞来做内对照比较好
niwanmao 发表于 2019-7-13 16:35:11
stf1990 发表于 2019-7-11 16:37
倪老师,FcR是否在B细胞表达较多,T细胞表达较少,因我们组在对T细胞进行染色时,无论有没有FcR blocking进 ...

相对来说,淋巴细胞整体背景就偏低些。B细胞应该没有那么高啊,是不是恰好是某个抗体问题?
Fc受体在各类细胞上的表达参见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6255-1-1.html
leosurely 发表于 2019-7-19 10:13:43
抗体滴定是个很重要的过程,除此之外在制备样本过程中,洗涤的次数也与阳性峰的位置有关。
112358answer 发表于 2020-4-30 15:04:05
做细胞系的话需要加Fc阻断吗?毕竟培养时候就有FBS
niwanmao 发表于 2020-5-1 15:12:05
112358answer 发表于 2020-4-30 15:04
做细胞系的话需要加Fc阻断吗?毕竟培养时候就有FBS

需要。
immunology1988 发表于 2020-5-7 16:02:34
112358answer 发表于 2020-4-30 15:04
做细胞系的话需要加Fc阻断吗?毕竟培养时候就有FBS

FBS对细胞系阻断有啥关系吗?
112358answer 发表于 2020-5-7 17:38:41
immunology1988 发表于 2020-5-7 16:02
FBS对细胞系阻断有啥关系吗?

我们一般不用Fc抗体阻断的话,就用FBS或者BSA封闭一下
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