多聚甲醛固定，究竟会对哪些免疫细胞计数产生影响？

niwanmao

用多聚甲醛（PFA）固定，是做流式检测最广泛使用的方法。许多基于PFA的方法，使用的PFA浓度从1-4%不等（Lal等人，1988；Chow等人，2005；Pinto等人，2005；Diks等人，2019）。尽管PFA固定的既定做法在本领域很普遍，但关于PFA固定对流式结果的影响，特别是关于外周血白细胞的数据很少。

1981年Lanier和Warner用1%PFA固定的染色细胞（包括正常人PB淋巴细胞），发现可在4ºC避光环境中储存至少1周，光散射或荧光特性或细胞群的相对比例没有明显变化（Lanier和Warner, 1981）。

相反，在1988年，Lal等人报告说，使用Lanier和Warner的方案，固定过的正常人PB淋巴细胞，需要额外洗涤才能去除与固定有关的误差（Lal等人，1988）。而Lanier和Warner只使用了FITC结合的抗体，Lal等人评估了FITC和PE抗体结合的不同组合来检测B细胞、T细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。对于大多数测试的组合，细胞能保持其荧光特性至少2周。然而，对于另一些组合，会出现染色特异性的丧失（即阴性细胞也出现阳性）或荧光强度的降低（即阳性荧光信号的丢失）。目前认为这些变化是由细胞膜的完整性和抗体的不稳定性、与荧光素的连接和/或与目标抗原的结合造成的，但不是由细胞释放的蛋白酶造成的。

2007年，Stewart等人使用FITC标记的抗体检测PB中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，在用1%PFA固定后立即进行纵向流式细胞仪分析，并在4天后逐渐增加。与Lanier和Warner以及Lal等人不同的是，Stewart等人观察到光散射和荧光特性随着时间的推移发生了明显的变化，而额外的洗涤不能避免这种变化（包括前向和侧向散射的逐渐减少，自发荧光的逐渐增加）（Stewart等人，2007）。

Vistica Sampino E等人分析了13个人免疫细胞群，结果发现，使用2%PFA的标准固定方案，会影响CD8、CD4和Treg、单核细胞和嗜碱性细胞的结果，因此必须谨慎。

下面直接看图，各个群体的未固定和固定后的结果对比。

CD8+T，对CD8+ TN和CD8+ EM有显示影响：



CD4+T，对CD4 TN、CD4 TE、CD4 TEM、CD4 TCM、TReg均影响明显：



B细胞，Naive B影响明显：



浆母细胞，无显著影响（流式中文网注：下图中的浆母细胞Plasmablast设门是错误的，应为CD38高表达CD24-那群，该文的Reviewer评审不细心，请大家注意）：



单核细胞，经典型和非经典型均有显著影响：



DC及其亚群，无显著影响：



NK细胞及其亚群，无显著影响：



干细胞，无显著影响：




中性粒细胞，无显著影响：



嗜酸粒细胞，无显著影响：



嗜碱粒细胞，有显著影响：





信源：Vistica Sampino E, Morgan J, Chorzalska A, et al. Comparative flow cytometry-based immunophenotyping analysis of peripheral blood leukocytes before and after fixation with paraformaldehyde [published online ahead of print, 2022 Oct 21]. J Immunol Methods. 2022;113379. doi:10.1016/j.jim.2022.113379